二甲双胍作用于3T3-L1前脂肪细胞诱导阶段对v-SNAREs蛋白家族mRNA表达的影响

2019-11-11 07:54霞2侯敬天欣3王建红4刘云峰
中西医结合心脑血管病杂志 2019年19期
关键词:分化培养基调控

任 毅,杨 霞2,侯敬天,吕 欣3,王建红4,刘云峰,杨 静

糖尿病是当今人类致死致残的主要原因之一,给社会发展和家庭带来了沉重经济负担,对于糖尿病采取降糖等有效管理,可以预防心血管疾病和糖尿病微血管并发症的发生[1]。根据国际糖尿病联盟统计,2015年全球的糖尿病患病人数已达4.15亿人,如不采取有效措施,预估到2040年糖尿病患病人数将达6.42亿人[2],因而防治糖尿病是当前国内外医学领域急迫解决的重要任务。2型糖尿病占糖尿病总人群90%以上,胰岛素抵抗是其主要的病理特征[3]。葡萄糖转运子4(GLUT4)胞吐与胞吞之间的动态平衡是葡萄糖保持正人亿,糖尿病相关的医疗费用将突破 8 020 亿美常摄取及血糖维持稳定的重要因素。GLUT4转运障碍以及GLUT4的表达或活性下降是导致机体胰岛素抵抗的重要分子机制[4]。囊泡相关可溶性N-乙酰基亚胺敏感因子附着蛋白受体(vescical-souble N-ethymaleimide sensitive factor attachment proteins receptor, v-SNAREs)在GLUT4囊泡的转运过程中起着非常关键的作用。

二甲双胍(Met)是2型糖尿病治疗的基石药物,但其作用机制尚未完全阐明。研究证实,Met可以促进GLUT4的表达,也可以调控GLUT4的转位和内吞[5-10]。主流观点认为Met是AMPK的天然激活剂,研究表明,Met主要经由AMPK信号途径对GLUT4转运进行调控,进而改善胰岛素抵抗[9-11]。深入的研究表明,Met对脂肪细胞GLUT4转运的调控可通过某些v-SNAREs介导完成[12-13]。v-SNAREs的主要蛋白为囊泡相关膜蛋白(vesicle associated membrane proteins,VAMPs)亚家族,目前共鉴定了7种亚型即VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、VAMP7、VAMP8[14]。本课题组前期研究也观察到在人网膜成熟脂肪细胞,Met可以通过调节VAMPs的表达而参与调控GLUT4 转运[15]。心肌细胞经Met长时间作用下(18 h)可以通过AMPK途径显著改善GLUT4的转运,提示延长作用时间可以更有效地发挥Met的作用[10]。因此推断将Met长时间作用于3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化过程,也可以改善脂肪细胞GLUT4的转运,且v-SNAREs在这一过程中扮演着重要角色。本研究将Met作用于3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化阶段,比较脂肪细胞成脂分化成熟后GLUT4、AMPK、VAMPs的mRNA表达水平,旨在探索Met在诱导分化阶段对v-SNAREs的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 美国Gibco公司的DMEM高糖培养基、双抗;赛业生物科技有限公司的小鼠脂肪间质干细胞成脂诱导培养基A液和B液、油红O染料;上海博士德的磷酸盐缓冲液(PBS)、胰酶;美国Sciencell公司的胎牛血清(FBS);美国Sigma公司的Met;上海生物工程技术服务有限公司的PCR试剂盒;美国Invitrogen公司的Trizol RNA提取液。

1.2 实验方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪细胞的培养及传代 购买3T3-L1前脂肪细胞(中国科学院的上海细胞库);将3T3-L1前脂肪细胞培养于DMEM高糖培养基(含10%FBS、1%双抗),置于细胞培养箱(37 ℃、5%CO2)内,间隔2~3 d换培养液,待细胞长满80%时进行传代。传代时弃掉原培养基,用PBS冲洗2次,然后加入胰酶(1 mL),2 min后终止消化,吹打均匀后移至离心管离心3 min(离心1 000 r/min)。离心后弃上清,加入1 mL完全培养基,吹打均匀,依照2×104个/cm2的密度于新培养瓶内接种,重复上述培养步骤。

1.2.2 3T3-L1前脂肪细胞的成脂诱导 3T3-L1前脂肪细胞在培养瓶内培养,待细胞生长的融合度达80%~90%时,依照上述步骤,6孔板中以2×104个/cm2的密度接种,继续培养。待6孔板的细胞融合度达到100%或过融合时,开始加入小鼠脂肪间质干细胞成脂诱导培养基诱导,交替给予A液2 mL诱导培养72 h(3 d),和B液2 mL诱导培养24 h(1 d),共交替3个周期(12 d)。

1.2.3 油红O鉴定 6孔板中成脂诱导结束后,吸弃培养基,予以PBS冲洗2次,每孔加4%甲醛液(2 mL)固定,30 min。吸弃甲醛液,予以PBS冲洗2次,每孔加油红O染液(1 mL)染色,30 min。吸弃油红O染液,予以PBS冲洗2次,将6孔板置于相差显微镜下观察成脂情况。成熟的脂肪细胞可见细胞质内染红的脂滴,呈串珠状排列,提示诱导成功。

1.2.4 分组与干预方法 依照加入的Met终浓度分为0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L 4组,每组3个复孔。将3T3-L1前脂肪细胞于6孔板接种培养,待细胞融合度达到100%或过融合时,分别在诱导分化阶段(12 d)持续加入成脂诱导培养基(A液或B液)1 960 μL和与终浓度相对应的Met液40 μL。

1.2.5 细胞mRNA的收集 将待测定细胞吸弃原培养基,每孔中加入TrizolRNA提取液0.5 mL,使细胞充分裂解后,移入2 mL的冻存管,置于液氮中冻存(-196 ℃),以备后续检测。

1.2.6 RT-PCR检测

1.2.6.1 引物设计 所有引物均由上海生工设计,软件使用Primer Premier 5.0,β-actin为内参基因。详见表1。

表1 基因引物序列

1.2.6.2 cDNA的合成 11 μL总RNA(1 μg),1 μL Random Primer p(dN)6(0.2 μg/mL),65 ℃孵育5 min;4 μL 5×Reaction Buffer,3 μL dNTP(10 mmol),1 μL RNA酶抑制剂(20 U/μL)和1 μL逆转录酶(20 U/μL),孵育:25 ℃10 min,42 ℃60 min,72 ℃15 min。

1.2.6.3 荧光定量PCR检测 10 μLSYBR Green Master (ROX),0.5 μL Forward引物(15 μmol), 0.5 μL Reverse 引物(15 μmol),2 μL cDNA,7 μL DNase/RNase-free的ddH2O,共合计20 μL。反应条件:95 ℃10 min,活化Tag酶;95 ℃15 s,60 ℃60 s,共循环40次。

2 结 果

2.1 不同浓度Met对成脂分化的影响 在诱导分化过程中持续给予0 mmol/L、0.5 mmol/L、1、2 mmol/L Met,经3周期诱导分化成脂后,经油红O染色后,经Met干预后,0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L 3组无明显变化,2 mmol/L染色明显变浅。详见图1~图4。

图1 Met 0 mmol/L组(×250)

图2 Met 0.5 mmol/L组(×250)

图3 Met 1 mmol/L组(×250)

图4 Met 2 mmol/L组(×250)

2.2 不同浓度Met对AMPK、GLUT4、VAMPs、mRNA表达的影响 比较不同组间AMPK、VAMP4、VAMP7 mRNA水平,差异无统计学意义(P>0.05)。4组间GLUT4 mRNA存在差异,进一步行LSD检验,1 mmol/L组较0 mmol/L组升高,且差异有统计学意义(P<0.05),2 mmol/L组较1 mmol/L组降低有统计学意义(P<0.05)。4组间VAMP2、VAMP3、VAMP5、VAMP8 mRNA比较差异有统计学意义(P<0.05),进一步行LSD检验:①与0 mmol/L组相比,0.5 mmol/L组VAMP2、VAMP 3、VAMP 8 mRNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05);②与0 mmol/L组相比,1 mmol/L组VAMP2、VAMP3、VAMP8 mRNA水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);③与1 mmol/L组相比,2 mmol/L组VAMP2、VAMP3、VAMP5、VAMP8 mRNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);④与0 mmol/L组相比,0.5 mmol/L组、2 mmol/L组VAMP5 mRNA表达水平降低(P<0.05)。详见表2。

3 讨 论

多个国家的糖尿病诊治指南中均推荐Met作为2型糖尿病病人控制血糖的一线用药和联合用药中的基本用药[1, 16]。充分的证据表明Met增强胰岛素敏感性的作用是通过激活AMPK实现的,Met实际上是一种天然的AMPK激活剂[12-13]。既往研究表明,Met可以通过AMPK途径调节GLUT4转运[11],但是至今尚未完全阐明GLUT4转运各步骤的具体分子调控机制。

表2 不同浓度Met对脂肪细胞AMPK、GLUT4、VAMPs mRNA表达的影响(±s)

与0 mmol/L组比较,1)P<0.05; 与1 mmol/L组比较,2)P<0.05

近年来的研究证实VAMPs为GLUT4转运过程中所必不可少的v-SNAREs蛋白家族,但VAMPs家族中各亚型在调控过程的具体作用颇有争议,各亚型之间的作用是相对独立还是可以相互替代,各实验结论并不一致,可能与在不同模型、不同刺激条件下的探索有关[17-18]。研究表明,VAMP2是介导GLUT4转运的主要v-SNAREs蛋白,对胰岛素刺激下的GLUT4储存囊泡胞吐过程尤为重要[19-22]。多数研究支持VAMP2在GLUT4转运过程中是不可或缺的[17, 23],但也有研究发现VAMP2可以被VAMP3或VAMP8所取代[18, 23]。在L6肌细胞中也观察到VAMP2参与调节胰岛素刺激下的GLUT4内吞过程[22]。VAMP3主要定位于不同阶段的内体,通常观点认为VAMP3介导了非胰岛素刺激下的GLUT4转运[24-25],但是在胰岛素抵抗模型中发现,VAMP3也参与了胰岛素刺激下的GLUT4转运,然而此作用必须持续依赖于VAMP2介入[26]。VAMP3可能调控GLUT4从早期内体向反面高尔基体网络(TGN)的转运[27]。VAMP8作用广泛,在多种细胞器上均可发现,研究表明,VAMP8的作用是介导了GLUT4的内吞[20, 28],基因敲除VAMP8的脂肪细胞,明显减弱GLUT4的内吞作用[20],从而使保留在细胞膜上的GLUT4增多,对葡萄糖摄取有促进作用。

脂肪组织是调控整体能量代谢的重要器官,脂肪细胞GLUT4转运的调控是机体控制葡萄糖的重要机制[29]。本实验在3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化过程中分别持续给予不同浓度的Met干预,研究结果显示Met可以作用于前脂肪细胞的诱导分化过程,1 mmol/L可能是Met在3T3-L1前脂肪细胞调控GLUT4的最大作用浓度,在1 mmol/L浓度范围内,随着Met浓度增加,可以上调脂肪细胞中GLUT4 mRNA的表达,呈现出一定的剂量依赖效应。同时,Met呈剂量依赖性的上调脂肪细胞中VAMP2、VAMP3、VAMP8 mRNA的表达,提示Met可以促进脂肪细胞GLUT4转运,v-SNAREs可能参与了Met对GLUT4转运的调控。然而当Met浓度达到2 mmol/L时,反而下调GLUT4、VAMP2、VAMP3、VAMP5、VAMP8 mRNA的表达,推测与成熟脂肪细胞数量相对不足有关。因为油红O染色的结果提示高浓度的Met可能抑制3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化,这与王慧等[30]的研究相类似。VAMP2、VAMP3、VAMP8在GLUT4存储囊泡上均有发现,脂肪细胞同时敲除 VAMP2、VAMP3、VAMP8 的3个亚型基因,可完全抑制胰岛素诱导的 GLUT4转运[18],提示VAMP2、VAMP3、VAMP8在调节GLUT4囊泡胞吐时具有至关重要的地位。当然VAMP3、VAMP8 亦介导非胰岛素刺激下的GLUT4转运。观察到Met在3T3-L1脂肪细胞诱导成熟阶段可以促进VAMP2、VAMP3、VAMP8的表达,但调控GLUT4转运的具体意义有待进一步明确。

在本研究中,不同浓度的Met并未影响AMPK的mRNA表达量,提示Met在诱导分化过程中可能通过促进AMPK的磷酸化,或者通过AMPK以外的其他途径影响v-SNAREs调控GLUT4转运。

在成脂诱导阶段持续予以Met处理,可以促进脂肪细胞GLUT4 mRNA的表达,Met对GLUT4转运的调控可能与其对v-SNAREs亚家族成员表达的调节相关,1 mmol/L可能为最大作用浓度,在1 mmol/L内其作用效果呈一定的浓度依赖性。此研究将为Met在调控GLUT4转运中的具体作用机制提供理论依据。

猜你喜欢
分化培养基调控
楼市调控是否放松
两次中美货币政策分化的比较及启示
碘-125粒子调控微小RNA-193b-5p抑制胃癌的增殖和侵袭
分化型甲状腺癌切除术后多发骨转移一例
食品微生物检验中培养基的质量控制探讨
鲁政委:房地产同城市场初现分化
双牌虎爪姜快速繁殖的培养基筛选
如何调控困意
经济稳中有进 调控托而不举
新兴市场货币:内部分化持续