雷公藤多苷对人口腔癌KB细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响

厉婷，周和超，陈驹

(1.广东医科大学附属医院药学部,广东 湛江 524001； 2.广东医科大学附属医院肿瘤中心,广东 湛江 524001)

口腔癌是人类头颈部常见的恶性肿瘤之一，其引发的并发症严重危害人类健康。据不完全统计，全球平均每年发病人数已达500万人，其中发展中国家和贫困地区人群是主要的患病人群[1]。有研究表明[2]，晚期口腔癌的患者5年存活率高达30%以上。近年来，随着全球经济快速发展，人民生活水平的提高，口腔癌的发病率显著上升，且发病人群有年轻化的趋势[3]。目前手术治疗是临床上最有效的治疗方法，但由于口腔癌起病相对隐匿，往往发现时已于晚期，错失了手术治疗的最佳时机[4]。此外，化学疗法也是口腔癌的重要治疗方法，治疗药物有氟尿嘧啶和顺铂等，但现有化疗方法不仅毒副作用大，且容易产生耐药性[5]。故寻找高效低毒的防治口腔癌药物仍然是科研工作者重中之重的任务。

雷公藤(TripterygiumWilfordiiHook.F)，性寒、味苦，归心、肝经，其具有消肿止痛、祛风除湿、活血通络、杀虫解毒的功效[6]。而雷公藤多苷是从雷公藤去皮根部所提取的总苷类化合物，素有“中草药激素”的美称，是我国首次研究利用且具有抗炎免疫调节作用的中药提取物，现已有药物上市[7]。雷公藤多苷的生理活性是由多种成分，如生物碱、三萜、二萜内酯等协同产生，它既保留了雷公藤的免疫抑制活性，又去除了许多毒性成分，故在临床上应用广泛[8]。目前，雷公藤多苷主要用于治疗皮肌炎、多种肾脏疾病、类风湿关节炎、红斑狼疮等多种自身免疫性疾病和炎症性疾病[9]。然而，雷公藤多苷对口腔癌的研究目前尚未见相关实验报道。本研究旨在探讨雷公藤多苷对人口腔癌KB细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响，初步阐明其作用机制，为雷公藤多苷抗口腔癌的临床应用提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 药物与试剂

雷公藤多苷片(上海复旦复华药业有限公司，批号：20180302)；细胞株(人口腔癌KB细胞，上海素尔生物科技有限公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；CCK-8、DMSO、RPMI-1640 细胞培养液(美国Amresco公司)；Annexin V-FITC /PI 凋亡检测试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司)；BCA 蛋白定量试剂盒(碧云天生物公司)；p-PI3K抗体、p-AKT抗体(美国Santa Cruz公司)；二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 主要仪器

CO2培养箱(Thermo Fisher Scientific)；Applied Biosystems PCR仪(美国ABI 公司)；BG-sub MIDI 电泳设备(美国Baygene公司)；Sunrise-Basci 酶标仪(瑞士Tecan公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)。

2 方法

2.1 细胞增殖抑制率检测(CCK-8法)

人口腔癌KB细胞采用含10%(φ)胎牛血清和双抗的RPMI-1640培养液，于37 ℃、5%(φ)CO2和饱和湿度条件进行常规培养。将处于对数生长期的人口腔癌KB细胞，采用胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为1×105/mL，以100 μL/孔的体积接种于96孔培养板中。培养24 h后，分别加入雷公藤多苷各浓度处理，使其终浓度分别为20、40、80、160 μmol/L，其中以0 μmol/L设定为对照组，每组6个复孔。继续培养24、48、72、96 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，并孵育5 h，于450 nm 处测定各组吸光度A值，分别计算雷公藤多苷处理24、48、72、96 h 后的细胞增殖抑制率。增殖抑制率=[1-A药物处理组/A对照组]×100%

2.2 细胞凋亡检测(流式细胞法)

将雷公藤多苷处理48 h后的人口腔癌KB细胞，于避光条件下分别加入PI和Annexin V/FITC各5 μL，20 min后，严格按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒操作说明书步骤，使用流式细胞仪测定雷公藤多苷处理组对人口腔癌KB细胞凋亡率的影响。

2.3 Bcl-2及Bax基因表达检测(real-time qPCR法)

将不同浓度雷公藤多苷处理48 h后的人口腔癌KB细胞，PBS轻轻冲洗2次，提取细胞总RNA(Trizol法)，并合成cDNA(RT-PCR法)。使用PCR仪检测Bcl-2及Bax基因表达情况，其中引物序列分别为Bax:F-5′-CGAATTGGCGAT GAACTGGA-3′，R-5′-CAAACATGTCAGCTGCCA CAC-3′;GAPDH:F-5′-GCACAGTCAAGGCTGAGA ATG-3′，R-5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，Bcl-2:F-5′-GACTGAGTACCTGAACCGGCATC-3′，R-5′-CTGAGCAGCGTCTTCAGAGACA-3′。

2.4 p-PI3K和p-AKT蛋白表达检测(Western blot法)

将雷公藤多苷处理48 h后的人口腔癌KB细胞，先加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，再使用BCA蛋白定量试剂盒定量。吸取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，10%胎牛血清封闭液封闭3 h，分别加入p-PI3K、p-AKT一抗4 ℃过夜。PBS洗膜3次后加入二抗，室温孵育2 h，PBS洗膜后使用ECL试剂分别进行化学发光、曝光、显影、定影。Image J软件对图像进行灰度分析，以GAPDH为参照。目的蛋白表达水平=目的条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

3 结果

3.1 雷公藤多苷对人口腔癌KB细胞增殖抑制率的影响

从图1结果可知，20、40、80、160 μmol/L雷公藤多苷给药组分别处理人口腔癌KB细胞24、48、72、96 h 后，其增殖抑制率均显著升高，呈浓度和时间依赖性。

3.2 雷公藤多苷对人口腔癌KB 细胞凋亡的影响

从图2结果可知，对照组及20、40、80、160 μmol/L雷公藤多苷组人口腔癌KB细胞48 h细胞凋亡率分别为(0.59±0.05)%、(9.34±0.84)%、(9.80±1.02)%、(14.25±2.31)%和(19.23±3.68)%; 与对照组比较，经雷公藤多苷处理后的KB 细胞凋亡率均显著升高(P<0.01) 。

20μmol/L40μmol/L80μmol/L160μmol/L35302520151050-5增殖抑制率/%244872960t/h

图1雷公藤多苷对人口腔癌KB 细胞增殖抑制率的影响

ABCDE

A.对照组； B.雷公藤多苷20 μmol/L组； C.雷公藤多苷40 μmol/L组； D.雷公藤多苷80 μmol/L组； E.雷公藤多苷160 μmol/L组。

图2雷公藤多苷对人口腔癌KB细胞凋亡的影响

3.3 雷公藤多苷对人口腔癌KB细胞Bcl-2、Bax mRNA表达的影响

结果如表1所示，与对照组比较，雷公藤多苷各组Bcl-2 mRNA表达显著降低，BaxmRNA表达显著升高(P<0.05或P<0.01)，呈浓度依赖性。

3.4 雷公藤多苷对人口腔癌KB细胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表达的影响

与对照组比较，雷公藤多苷组细胞的p-PI3K和p-AKT 蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)，呈浓度依赖性。

表1 雷公藤多苷对人口腔癌KB 细胞Bcl-2、BaxmRNA表达的影响

组别剂量/(μmol·L-1)Bcl-2 mRNABax mRNA对照组-0.73±0.130.47±0.03雷公藤多苷组200.58±0.09∗0.62±0.06∗400.45±0.07∗∗0.76±0.08∗∗800.36±0.08∗∗0.83±0.12∗∗1600.16±0.05∗∗0.96±0.14∗∗

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

12345p-PI3Kp-AKTGAPDH1.00.80.60.40.20.0p-PI3K表达12345**************0.60.40.20.0p-AKT表达AB

1.对照组； 2.雷公藤多苷20 μmol/L组； 3.雷公藤多苷40 μmol/L组； 4.雷公藤多苷80 μmol/L组； 5.雷公藤多苷160 μmol/L组。 与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

图3雷公藤多苷对人口腔癌KB 细胞p-PI3K(A)和p-AKT(B)蛋白表达

4 讨论

口腔癌是一种由于多种因素(生活方式、环境因素、遗传因素等)共同作用所产生的一种恶性程度较高的肿瘤。关于口腔癌的发病机制目前尚未完成阐明，可能与人乳头瘤病毒感染、不良生活习惯、抑癌基因失活等有关[10]。临床上也无有效应对措施，因此探索皮肤癌的发生机制以及寻找有效治疗药物是目前亟待解决的问题。

增殖与分化异常是肿瘤细胞的两个基本特征，其中抑制肿瘤细胞异常增殖是评价抗肿瘤药物效果的一个较为直接的重要指标[11]。本研究发现雷公藤多苷对人口腔癌KB细胞的增殖具有明显的抑制作用，且在一定剂量浓度范围，随着雷公藤多苷浓度的升高和处理时间的延长，对人口腔癌KB细胞增殖抑制率也随之升高，呈浓度和时间依赖性。Bcl-2家族主要由抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax组成，它们也是线粒体凋亡途径过程中最重要的调节因子[12]。Bcl-2主要通过减少线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用，而Bax主要通过升高线粒体膜通透性和促进细胞色素C的释放而起到诱导凋亡作用[13]。Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键蛋白，可直接作为凋亡的效应分子，可引起细胞染色质凝集、DNA片段化，从而导致细胞的凋亡[14]。本研究发现雷公藤多苷可显著降低人口腔癌KB细胞的Bcl-2 mRNA表达，而显著升高BaxmRNA表达(P<0.05或P<0.01)，且呈浓度依赖性，提示了雷公藤多苷可能通过影响线粒体途径，下调Bcl-2基因表达，上调Bax基因表达，从而激活Caspase-3的活性，最终引起细胞的凋亡。

近年来，作为细胞生存的重要通路，PI3K/AKT信号通路在促进增殖、促进血管生成、抵抗放化疗、侵袭、抑制凋亡等方面受到了广泛的关注[16]。多种恶性肿瘤中PI3K/AKT信号通路表达异常，如肺癌、卵巢癌和乳腺癌等[17]。PI3K是正常人体内一种磷脂激酶，由调节亚基(p85)和催化亚基(p110)组成，丝氨酸/苏氨酸激酶AKT是PI3K主要下游效应物。研究发现AKT在PI3K/AKT信号通路中已拥有100个以上的下游底物，其在调节细胞存活、增殖和凋亡中起着至关重要的作用[18]。近期研究表明p-AKT在口腔鳞状细胞癌中过表达，提示p-AKT可能参与了口腔癌早期阶段的发生发展[19]。本研究发现雷公藤多苷可以明显降低人口腔癌KB细胞的p-PI3K 和p-AKT 蛋白表达水平，且呈浓度依赖性。提示雷公藤多苷通过抑制PI3K/AKT信号通路，从而促进人口腔癌KB细胞的凋亡。

综上所述，雷公藤多苷具有抑制人口腔癌KB细胞增殖和诱导凋亡作用，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的激活有关。