茯苓多糖对人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的影响及机制

胡康 罗清 朱晓峰 程晓明 冯国丽 刘正芸 孙素红

(遵义医学院 1附属医院甲乳外科，贵州 遵义 563000；2附属医院肿瘤研究室；3医学与生物学研究中心)

乳腺癌是全球女性肿瘤死亡率最高的癌症之一。目前手术切除、放疗、化疗、放疗及分子靶向治疗等是针对乳腺癌治疗的主要手段〔1〕。在这些诊疗手段中，临床发现部分药物有明显的毒副作用，且患者易对其产生耐药性〔2〕。特异富含AT序列结合蛋白(SATB)-1是一种组织特异性核基质结合蛋白，在乳腺癌病理切片及乳腺癌细胞株中均可以检测到SATB-1过表达，提示SATB-1可能是乳腺细胞癌变的关键蛋白，在乳腺癌侵袭转移中起到决定性作用〔3〕。Kohwi-Shigematsu等〔4〕在检测相关基因图谱发现，SATB-1可以通过调节近1 000个基因来促进肿瘤的侵袭转移，提示其在乳腺癌发生的不同阶段起到重要作用。前期研究筛选发现茯苓中多糖类成分具有抑制MDA-MB-231细胞迁移作用。茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf属于为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，传统上用于治疗水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠，在《本草正》《本草纲目》和《神农本草经》均有相关记载〔5〕。研究显示，茯苓的主要化学成分为多糖类化合物，其包括茯苓糖、β-茯苓聚糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、硬烷和纤维素等〔6〕。本实验探索茯苓多糖(PPS)抑制MDA-MB-231细胞迁移活性，并分析其对SATB-1基因调控的作用机制及潜在的抗癌药用价值。

1 材料和仪器

1.1材料 茯苓5.0 kg(产地安徽)购自上海康桥中药饮片有限公司，阴离子交换树脂(DEAE Sepharose Fast Flow)和分子筛凝胶柱(Superdex-75)购自GE Healthcare；普鲁兰多糖P-82标准品套装购自Shodex；单糖标准品和三氟乙酸(TFA)购自西格玛公司，氯化钠和乙醇购自国药集团；其他试剂均为分析纯。人乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，L-15 培养基购自Hyclone公司，TRIzol购自Invitrogen公司，Transwell小室购自康宁，细胞计数试剂盒(CCK)-8购自宝生物，胰酶和胎牛血清购自Gibco公司。

1.2仪器 高效液相色谱仪(HPLC)为安捷伦1100系列，配备示差折光检测器(RI)；GC/MS色谱仪为安捷伦7890B型GC/7693型三重四级杆质谱仪(GC-TQTMMS)，TRACE TR-5毛细管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)购自赛默飞公司；多糖分离系统配置RI检测器购自利穗科技；电子天平购自赛托利斯；冷冻干燥机购自LABCONCO；酶标仪购自Molecular Device，荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪为ABI7900系列购自美国ABI。

1.3PPS提取及分离纯化 PPS的提取和分离过程参见本课题组已发表文献〔7〕，活性最强洗脱组分PPS10经Superdex75分子筛凝胶柱层析，得PPS10-2。

1.4多糖纯度和相对分子量测定 参考文献〔7〕方法，采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法测定低聚糖的纯度及相对分子量。

1.5单糖组成分析 参考文献〔8〕方法，采用还原水解法进行糖组成分析。

1.6细胞活力检测 人乳腺癌MDA-MB-231细胞株用含有10%胎牛血清(FBS)的L-15培养基在37℃含5% CO2的培养条件下正常培养。待细胞达到90%融合时，按5×104/孔的细胞密度接种于96孔板，细胞继续培养24 h后，分别加入不同浓度的茯苓样品处理20 h，然后用CCK-8于490 nm处测量吸光度并计算细胞活力。

1.7细胞迁移实验 人乳腺癌MDA-MB-231细胞株用含有10% FBS的L-15培养基在37℃含5% CO2的培养条件下正常培养。待细胞达到90%融合时，消化细胞并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次，用无血清培养基重悬细胞并计数，在transwell各孔上室分别加入200 μl细胞悬液，其细胞密度为1.5×105/孔。在下室加入500 μl含10%FBS的培养基后，将小室置于培养箱中继续培养20 h。取出transwell小室，用PBS缓慢洗涤3次，用甲醇固定10 min后随即用2%结晶紫染色15 min，在镜下观察时随机选取5个高倍镜下视野进行拍照和计数。

1.8SATB-1基因表达实验 人乳腺癌MDA-MB-231细胞株用含有10% FBS的L-15培养基在37℃含5% CO2的培养条件下正常培养。待细胞达到90%融合时，消化细胞并将其按照2×105/孔密度接种于12孔板，细胞继续培养24 h后，分别加入不同浓度的茯苓样品处理20 h，用TRIzol法提取总RNA，然后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SATB-1基因表达。引物设计序列为：SATB-1正义：AACGAGCAGGAATCTCCCAGGCG；反义：ACCAGTGGGTACGCGATGA。 GAPDH正义：GATGAGATTGGCATGGCTTT；反义：CAGAAGTGGGGTGGCTT。

1.9统计方法 采用t检验。

2 结 果

2.1PPS对MDA-MB-231细胞活力的影响 不同浓度PPS处理MDA-MB-231人乳腺癌细胞株24 h后，细胞活力〔(104.0±3.8)%、(106.0±3.6)%、(109.4±6.2)%〕没有受到影响(P>0.05)，空白对照组细胞活力为〔(100.0±3.0)%〕；表明PPS在50，100和200 mg/L没有明显细胞毒性。

2.2PPS对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 100和200 mg/L的PPS处理细胞20 h后，对MDA-MB-231细胞迁移均有较强的抑制作用，每视野细胞迁移数分别为(54±21)、(46±7)个，与空白对照组〔(377±79)个〕差异显著(P<0.05)。见图1。

图1 PPS对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响(结晶紫染色，×100)

2.3PPS的分离纯化 茯苓样品经DEAE Sepharose Fast Flow分别以H2O、0.1、0.2、0.5和1.0 mmol/L NaCl洗脱分离后，被依次分为5个部分PPSW、PPS1、PPS2、PPS5和PPS10；活性跟踪检测获得最强部位PPS10，再经Superdex75纯化，获得多糖PPS10-2。

2.4PPS10-2的纯度和分子量测定 PPS-10-2的HPGPC呈单一峰(图2)，表明PPS10-2为均一多糖。经HPGPC法检测和Cirrus GPC软件分析测得PPS10-2相对平均分子量为5 761 D。

2.5单糖组成分析 PPS10-2主要含鼠李糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖=10∶3.3∶7.0(图3)。

2.6PPS10-2对MDA-MB-231细胞活力的影响 不同浓度(50，100，200 mg/L)PPS10-2处理24 h后，细胞活力〔(112.3±3.9)%、(105.5±3.9)%、(102.7±3.7)%〕没有受到影响(P>0.05)，空白对照组为(100.0%±6.1%)；表明PPS10-2在50，100和200 mg/L不同浓度下对MDA-MB-231细胞无毒性。

图2 PPS10-2的HPGCP图谱

A.PPS10-2；B．单糖混合对照品，1．D-鼠李糖，2.L-岩藻糖，3.D-阿拉伯糖，4.D-木糖，5.D-甘露糖，6.D-葡萄糖，7.D-半乳糖图3 PPS10-2单糖组成分析气相色谱

2.7PPS10-2对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 细胞处理20 h后，100 mg/L PPS10-2对MDA-MB-231细胞迁移〔每视野迁移细胞数为(55±8)个〕均有较强的抑制作用，与空白对照组〔(303±15)个〕差异显著(P<0.05)(图4)。

2.8PPS10-2对SATB-1基因的调控 经100 mg/L的PPS10-2处理细胞20 h后对SATB-1抑制作用明显，SATB-1表达量为0.6，空白对照组为1.0，两组差异显著(P<0.05)。表明PPS10-2可能是通过抑制SATB-1基因来抑制MDA-MB-231细胞迁移。

图4 PPS10-2对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响(结晶紫染色，×100)

3 讨 论

SATB-1是一种组织特异性表达的核基质序列特异性结合蛋白，与肿瘤的侵袭迁移密切相关。通过调控SATB-1可以对肿瘤相关目标基因进行调控，从而进一步调节细胞分化和凋亡，从而影响肿瘤细胞的发展和转移。SATB-1在乳腺癌患者组织中有高表达，然而在正常组织中没有表达〔9，10〕。敲除SATB-1基因后可以发现其可以逆转乳腺癌癌细胞的表型，对于肿瘤的发生、增殖和转移有一定的抑制作用。乳腺癌中SATB-1可以通过直接上调肿瘤相关基因和下调肿瘤抑制基因从而对肿瘤的发生，转移及预后起宏观调控的作用〔4，11〕。多种基因可以参与和调控肿瘤的转移机制，这一复杂过程主要包括原发灶分离、浸润血管和淋巴及内皮细胞黏附、分解基质、外渗，导致血管生成并逃避抗肿瘤免疫应答，最终在转移部位生长〔12～14〕。本实验结果表明PPS和PPS10-2在检测的最高浓度200 mg/L时对细胞没有明显的毒性作用。其次，在处理高侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-231后，乳腺癌细胞的迁移被显著抑制，结果显示PPS和均一多糖PPS10-2能显著降低其体外迁移的能力。PPS及均一多糖PPS10-2可能是通过抑制SATB-1来降低MDA-MB-231细胞的体外迁移能力，由此阐明PPS中可能是均一多糖PPS10-2成分通过下调SATB-1来抑制MDA-MB-231细胞迁移作用，从而抑制乳腺癌细胞的转移。