雏菊叶龙胆酮对小鼠脑缺血损伤模型的影响及机制

郑渤 胡慧敏 赵志英 陈彪 李彪 云娜

(1内蒙古科技大学包头医学院麻醉学院，内蒙古 包头 014040；2内蒙古巴彦淖尔市医院麻醉科；3内蒙古科技大学包头医学院麻醉学专业2016级本科生)

缺血性脑血管病是神经内科常见疾病，且已成为我国国民死亡的首要原因。但目前的临床治疗手段非常有限，有限的时间窗内溶栓及介入治疗虽然可以降低死亡率，但脑缺血损伤的药物治疗仍然是目前阻碍治疗的世界性难题。龙胆科獐牙菜属植物，为我国传统蒙药药用植物。研究发现，龙胆科植物中分离提取得到的化合物——雏菊叶龙胆酮具有广泛的生物学活性作用，如抗氧化、抗菌、抑制胆碱酯酶及单胺氧化酶、保护心血管系统等〔1,2〕。本课题组前期研究从内蒙古道地药材尖叶假龙胆(蒙药名：阿古特-其其格)中分离提取出雏菊叶龙胆酮(Bellidifolin)，并发现具有一定的抗脑缺血作用，其作用机制可能与通过抑制氧化应激反应和抑制兴奋性氨基酸产生、提高脑组织γ-氨基丁酸(GABA)含量有关〔3〕。本研究拟通过结扎小鼠双侧颈总动脉的方法复制动物脑缺血损伤模型，探究雏菊叶龙胆酮对缺血性脑损伤的保护作用及其作用的信号通路。

1 材料与方法

1.1实验材料 3月龄健康雄性C57BL小鼠30只，由内蒙古科技大学实验室提供，Scxk(蒙)2016-0001。雏菊叶龙胆酮购自四川维克奇生物科技有限公司(纯度均≥98%)，兔抗细胞外调节蛋白激酶(ERK)、氨基末端激酶(JNK)、p-38MAPK、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3购自CST公司。 体重(25.7±1.5)g，按照随机数字表将小鼠随机分为假手术(C)组、脑缺血损伤(AD)组、 雏菊叶龙胆酮高剂量组(100 mg/kg，H组)、中剂量组(75 mg/kg,I组)、低剂量组(50 mg/kg,L组)，每组6只。

1.2脑缺血模型的建立 将小鼠用质量分数4%的水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔麻醉后，仰卧固定于操作台上，备皮、消毒后于颈前正中部位做一个1～2 cm的矢状切口，气管两侧分离出双侧颈总动脉、迷走神经，动脉夹夹闭双侧颈总动脉，观察小鼠的瞳孔大小和翻正反射。脑缺血模型制作成功的标准是夹闭双侧颈总动脉2 h后虽正反射消失，双侧瞳孔放大但可以自主呼吸。实验过程中小鼠出现抽搐症状或小鼠死亡即建立模型失败。

1.3Western印迹检测相关蛋白表达 小鼠麻醉后，断头取脑，冰上分离双侧脑皮质、海马备用。分离脑组织并超声粉碎，提取蛋白，并用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测定蛋白浓度。琼脂糖凝胶电泳后运用ImageJ图像分析软件测得条带灰度值，将各目的条带与内参条带比值后，比较各组间差异。

1.4统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组脑组织caspase-3蛋白表达水平比较 与C组(0.365±0.018)比较，AD组缺血侧脑组织caspase-3蛋白表达水平(0.843±0.051)显著增加(P<0.05)；L组、I组、H组(0.805±0.023、0.674±0.053、0.313±0.009)显著低于AD组(P<0.05)，且与剂量呈相关性，见图1。

2.2各组脑组织p38MAPK蛋白表达水平 与C组(0.412±0.015)比较，AD组缺血侧脑组织p38MAPK蛋白表达水平(1.179±0.102)显著增加(P<0.05)；L组、I组、H组(0.871±0.031、0.762±0.101、0.631±0.017)显著低于AD组(P<0.05)，且与剂量呈相关性。见图2。

图1 各组脑组织caspase-3蛋白表达

图2 各组脑组织p-p38MAPK蛋白表达

2.3各组脑组织p-JNK蛋白表达水平 与C组(0.447±0.059)比较，AD组缺血侧脑组织p-JNK蛋白表达水平(1.151±0.071)显著增加(P<0.05)；L组、I组、H组(0.100±0.011、1.010±0.052、0.712±0.102)显著低于AD组(P<0.05)，且与剂量呈相关性。见图3。

图3 各组脑组织p-JNK蛋白表达

2.4各组脑组织p-ERK蛋白表达水平 与C组比较，AD组脑组织p-ERK表达变化不明显。见图4。

图4 各组脑组织p-ERK蛋白表达

3 讨 论

脑缺血损伤是由于一系列复杂的生化和分子机制如促凋亡蛋白和促炎细胞因子等因素导致的大脑、小脑及脑干等局部或多部位缺血，进而引起相关神经功能异常的疾病〔4〕。由于脑血管疾病具有高发病率、高致残率及高死亡率等特点，已成为中老年患者获得最佳疗效的主要难题〔5〕。虽然目前临床应用的西医手段如介入治疗等效果显著，但术后不良反应、高额的手术费用及可能的二次灌注损伤都是亟待解决的问题。中药有效成分由于其作用明显，安全性高，临床疗效显著，通过多途径发挥作用而成为国内外研究的热点和前沿〔6，7〕。

体外实验表明，雏菊叶龙胆酮对低氧诱导的PC12细胞损伤具有保护作用，雏菊叶龙胆酮抑制细胞凋亡，机制是通过抑制p38MAPK信号通路激活下游caspase-3、提高Bcl-2/Bax的表达而实现〔7〕。雏菊叶龙胆酮又名雏菊叶龙胆素，主要存在于龙胆科獐牙菜属、假龙胆属、龙胆属植物中〔8〕。研究表明，雏菊叶龙胆酮具有多种生物学活性，高佳琪〔9〕研究发现，雏菊叶龙胆酮可改善糖代谢促进糖消耗，发挥降血糖作用，其机制可能是雏菊叶龙胆酮参与调控胰岛素的基因表达，影响相关蛋白的磷酸化水平及蛋白表达水平。有研究表明，雏菊叶龙胆酮可能通过减轻氧化应激水平，发挥对胰岛的保护作用〔10〕。雏菊叶龙胆酮可以在人体内的内皮转化过程中对过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激反应发挥保护作用〔11〕。雏菊叶龙胆酮参与神经损伤后的修复，雏菊叶龙胆酮可促进坐骨神经损伤后功能恢复，可促进神经功能恢复〔12〕。

MAPK信号转导通路可以参与调控多种细胞生物学效应，尤其是在细胞增殖、分化及凋亡过程中，是多种信号转导途径的共同作用部位。MAPK被激活后转移至细胞核内，使一些转录因子发生磷酸化，改变细胞内基因表达的状态。有研究认为ERK通路的激活主要是促进细胞存活和抑制凋亡，而JNK和p-38MAPK通路的激活主要与细胞凋亡有关〔13〕。p-38MAPK已被证明可以通过激活其下游的激酶和转录因子，加速细胞凋亡，造成脑缺血损伤的进一步发展〔14〕。活化的JNK参与调节细胞的增殖分化、凋亡、胚胎发育、癌基因的转化等多种生命过程，JNK代表了保护脑免受缺血性脑卒中的治疗靶点〔15〕。本课题组前期研究表明，雏菊叶龙胆酮可有效抑制低氧所致的PC12细胞凋亡，其机制可能与抑制p-38MAPK信号通路的活化及下游caspase-3的表达有关〔16〕。本研究发现，雏菊叶龙胆酮可以下调p-38MAPK、p-JNK的表达，进而降低脑缺血引起的caspase-3表达升高，抑制脑组织细胞凋亡。再次证明雏菊叶龙胆酮具有一定的抗脑缺血作用，其通过影响MAPK信号转导通路参与对缺血损伤细胞凋亡程度的调控。