中药千金子对肾癌Renca细胞凋亡的影响及其机制

赵俊峰 李豪 雷震 张嘉琪 张林超 孙继建 潘世杰 苏晓斐 肖耀军

(河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院 1泌尿外科，河南 郑州 450002；2中心实验室；3武警广东总队医院泌尿外科)

千金子亦称“蒲萨豆、千两斤”是大戟科类植物随续子Euphorbia lathyris L的干燥成熟的种子〔1〕。最早在20世纪20年代已有国外学者对大戟科类中药千金子进行了相关研究，现代科学研究也表明千金子具有抗多种肿瘤细胞的药理学活性，临床已有报道千金子用于治疗食管癌、皮肤肿瘤、急性淋巴细胞性白血病等均有较好的疗效〔2〕。我们前期的研究发现千金子二萜醇对肾癌Renca细胞具有较强的抑制作用〔3,4〕，但是其对肾癌Renca细胞凋亡及其机制的影响尚不清楚。本研究以肾癌Renca细胞为模型，运用流式细胞技术，十二烷基硫代硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术，检测千金子二萜醇作用后肾癌Renca细胞凋亡的变化情况，探讨千金子引起肾癌Renca细胞凋亡可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1材料与试剂 小鼠肾癌Renca细胞购买自北京鼎国昌盛生物科技有限公司。千金子二萜醇(批号：wkq18030201 CAS:34420-19-4，纯度：HPLC≥98%,规格：20 mg/支，四川维克奇生物科技有限公司)，将药品溶解到200 μl的二甲基亚砜(DMSO)中，细胞实验前使用RPMI-1640培养基进行溶解，经过滤除细菌后稀释至实验所需的浓度备用。主要试剂如RPMI-1640培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清、胰蛋白酶均购自Hyclone公司；AnnexinV-FITC细胞凋亡的试剂盒购于凯基生物科技有限责任公司。本实验所用的一抗、二抗均购买于美国Rockland公司。双抗(青霉素、链霉素)、BCA测量蛋白浓度试剂盒购买自武汉汉恒生物科技有限公司；裂解细胞液(RIPA和PMSF)购于上海碧云天生物科技有限公司。实验仪器有细胞实验超净工作台(上海净化设备公司)；CO2细胞培养箱(Thermo,美国)；倒置显微镜(日本，Canon)；流式细胞仪为美国贝克曼公司生产的产品；TDZ4-WS型低温高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司生产)；恒温水浴锅(上海机器设备厂生产)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 从-80℃的冰箱中取出冻存的肾癌Renca细胞，置于37℃恒温水浴锅中迅速复苏。肾癌Renca细胞培养于体积分数为10%的胎牛血清、青霉素及链霉素各100 U/ml的RPMI1640细胞培养基中，在37℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下常规培养，当细胞融合达到75%～80%以上，胰蛋白酶消化传代。细胞呈单层贴壁后，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2细胞凋亡的检测 同样取对数生长期的肾癌Renca细胞，用单纯RPMI1640调整细胞密度为3×105/ml，同样均匀加样于6孔细胞培养板置于细胞恒温培养箱中常规培养24 h待贴壁后实验组加入千金子二萜醇(9 000 μg/ml)，对照组加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，预处理细胞，再常规培养24 h后，使用5%的不含EDTA胰酶消化后，加入培养基收集细胞2 000 r/min离心2次。严格按照试剂盒操作步骤：依次加入500 μl的缓冲液、5 μl AnnexinV、5 μl PI后常温避光反应30 min，于1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡情况，所得结果用Flowjob软件分析。

1.2.3Western印迹法检测肾癌Renca细胞凋亡相关蛋白的表达 将细胞接种到6孔板中，实验组和对照组各3复孔。37℃、5%CO2条件下常规培养，药物作用肾癌Renca细胞24 h后，提取总蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白的拟合浓度曲线、并计算上样浓度。然后取50 μg蛋白进行SDS-PAGE实验，湿转法转移至PVDF膜上，5%的脱脂高钙奶粉37℃封闭1.5 h，根据蛋白质的分子量大小进行裁剪，TBST洗膜共5次，每次5 min。一抗放置于4℃冰箱孵育过夜，加入二抗常温孵育2 h后，泡入显影液。随后在ChemiDoc成像系统中进行ECL曝光显影,与β-actin做内参对照。

1.3统计学分析 采用SPSS24.0统计学软件进行t检验。

2 结 果

2.1千金子对肾癌Renca细胞凋亡的影响 与对照组早期凋亡率〔(3.8±3.12)%〕和晚期凋亡率〔(7.2±2.46)%〕相比较，千金子作用于小鼠肾癌Renca细胞24 h后，细胞的早期凋亡率〔(28.3±2.16)%〕和晚期凋亡率〔(36.7±4.13)%〕均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2千金子对肾癌Renca细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的影响 与对照组相比较，千金子作用肾癌Renca细胞后凋亡蛋白Caspase-3的表达水平显著提高，促凋亡蛋白Bax表达水平亦有所增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达水平显著下降，见图1。

图1 Western印迹检测千金子对Renca细胞凋亡相关蛋白的影响

3 讨 论

肾癌是严重威胁人类生命健康的泌尿系常见恶性肿瘤，占成人全身恶性肿瘤的2%～3%〔5〕，并且每年肾癌的发病率以2.5%速度不断增加〔6〕。绝大多数肾细胞癌发病较为隐匿，而且对放化疗缺乏敏感性，纵然外科手术是肾癌治疗的唯一有效方法，仍有不少患者术后再次出现复发和转移。因此，寻求肾细胞癌新的治疗途径，对于延长患者的寿命、改善患者的生活质量将有着重大的意义。本课题组前期的研究发现，中药千金子对小鼠肾癌Renca细胞具有较强的细胞毒作用，当药物浓度达到9 000 μg/ml时抑制率高达64.65%〔3〕，基于前期实验研究的基础，我们进一步研究了千金子对肾癌Renca细胞凋亡,揭示千金子抗肿瘤凋亡分子机制。

细胞凋亡的生物学事件是由基因决定的程序性死亡，肿瘤细胞无限制的增殖与肿瘤细胞的凋亡减少有关〔7〕。细胞的凋亡途径主要包括内部的线粒体途径和外源性死亡受体介导信号传导的两大经典途径，两条途径最终激活Caspase引起肿瘤细胞发生凋亡〔8,9〕。线粒体途径细胞凋亡主要有赖于促凋亡基因Bax及抗凋亡基因Bcl-2表达的抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白相互影响，参与形成细胞生命活动的调控，并在凋亡因子的刺激下激活下游的Caspase级联反应，诱导细胞凋亡的发生〔10〕。本研究表明千金子作用肾癌Renca细胞后，与对照组相比较促凋亡蛋白Bax的表达水平有所升高、抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降、半胱氨酸蛋白酶Caspase-3出现裂解片段，而且表达水平明显升高；Hsieh等〔11〕研究报道了千金子通过抑制Bcl-2的表达，促进Bax的表达水平降低线粒体细胞色素C，最终诱导宫颈癌细胞凋亡，与本研究的结果一致；Gillespie等〔12〕和Fallahian等〔13〕的研究均证实千金子是通过线粒体凋亡的途径诱导黑色素瘤细胞和A357细胞发生凋亡，提示中药千金子诱导肾癌Renca细胞的凋亡的分子生物学机制不仅与影响肾癌细胞内凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的表达相关，还很可能与影响肾癌细胞线粒体膜电位的变化有关。然而，中药千金子抗肿瘤作用方面的研究基本停留在体外细胞实验水平，千金子的动物体内抗肿瘤相关的研究有待进一步研究。