miR-204-5p靶向ZEB1调控EMT途径影响胃癌细胞侵袭转移的机制研究

马铁军，任利，王燕德

胃癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，侵袭和转移是导致胃癌患者死亡的重要原因。胃癌的发病机制尚未完全明确，探索胃癌侵袭、转移的相关机制，对胃癌的早期诊断、治疗、预测肿瘤复发转移和评估预后具有重大意义[1]。近年来，随着肿瘤分子生物学的发展，分子靶向治疗逐渐成为胃癌治疗的新途径。微小RNA(microRNA，miRNA)是细胞间重要的信息交流介质，研究发现其参与胃癌发生、发展，腹膜转移等，可作为胃癌诊断的新生标志物及治疗的潜在靶标[2]。研究发现miR-204在胃癌组织以及胃癌细胞株中低表达，与TNM分期、淋巴结转移以及分化程度有关，miR-204过表达能抑制胃癌细胞的增殖，并能促进其细胞凋亡[3]。miR-204-5p通过下调USP47与RAB22A的表达能抑制胃癌细胞增殖，发挥抑癌基因功能[4]。miR-204-5p在人结直肠癌中也低表达，且能抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)[5]。锌指E盒增强子结合蛋白1(zinc-finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)是E-cadherin基因的转录抑制因子，影响细胞的粘附性和移动性，调节EMT进展；干扰ZEB1的表达能降低胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，增高E-cadherin的表达[6]。但miR-204-5p对胃癌细胞侵袭和迁移的影响及miR-204-5p是否通过ZEB1影响胃癌细胞侵袭和迁移还尚未可知，本实验旨在研究miR-204-5p对胃癌细胞侵袭和迁移的影响及miR-204-5p是否通过ZEB1影响胃癌细胞侵袭和迁移。

1 材料与方法

1.1 材料

胃癌细胞株AGS、SGC-7901、MGC-803和正常胃黏膜上皮细胞株GES-1购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibico公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；MTT试剂盒、DMSO、BCA试剂盒、PBS缓冲液购自Sigma公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体购自北京博奥森生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel胶购于美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 胃癌细胞AGS、SGC-7901、MGC-803和正常胃黏膜上皮细胞GES-1用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，每2天换液一次，待细胞融和至80%左右时，加入胰蛋白酶进行消化传代，选取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染与分组 取常规培养的胃癌细胞SGC-7901用0.25%胰蛋白酶消化后接种于96孔板中，待细胞生长至80%融合，更换为无血清培养基同步化12 h，随后进行转染。转染分为miR-con组(转染miR-con)、miR-204-5p组(转染miR-204-5p mimics)、si-con组(转染si-con)、si-ZEB1组(转染si-ZEB1)、anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、anti-miR-204-5p组(转染anti-miR-204-5p)、miR-204-5p+pcDNA组(共转染miR-204-5p和pcDNA)、miR-204-5p+ pcDNA-ZEB1组(共转染miR-204-5p和pcDNA-ZEB1)，转染按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作。

1.2.3 qRT-PCR检测miR-204-5p和ZEB1 mRNA表达水平 收集各组细胞，研磨充分后加入Trizol试剂提取总RNA，微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。使用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照TaKaRa 荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，以β-actin为内参进行PCR扩增，每个样品重复3次，循环条件为95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环；60 ℃延长5 min。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.2.4 Western blot检测蛋白的表达 收集各组细胞，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃，12 000 g离心15 min，收集蛋白上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，5% 脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，后在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。每个蛋白样品设3个重复。

1.2.5 MTT检测细胞活性 在各组细胞培养至24 h、48 h、72 h、96 h时加入20 μL(5 g/L)的MTT溶液，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150 μL DMSO振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。细胞活性(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.2.6 Transwell检测细胞迁移和侵袭 在各组细胞，胰酶消化后使用无血清培养基重悬细胞，调整浓度为2×104个/mL。细胞迁移实验：取200 μL细胞悬液接种于Transwell小室上室中，并置于含完全培养基的下室中，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，取出小室，去除培养基后用棉签轻轻擦去上层细胞，PBS洗涤，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，显微镜观察并随机选取5个视野拍照，计算结晶紫染色细胞数即为迁移细胞数。细胞侵袭实验：以1∶5比例加入RPMI 1640培养液稀释Matrigel后，铺于Transwell小室的上室，室温下干燥后，按照细胞迁移实验步骤操作。最后显微镜下观察结晶紫染色细胞数即为侵袭细胞数。

1.2.7 荧光素酶报告基因检测实验检测miR-204-5p对ZEB1的靶向调控 TargetScan数据库显示ZEB1 3′UTR区域有miR-204-5p结合位点。构建野生型和突变型基因靶点ZEB1的3′UTR-荧光素酶表达载体(ZEB1-WT和ZEB1-MUT)，取对数生长期胃癌细胞接种于24孔板(5×104个/孔)，待细胞生长至80%融合时，用LipofectamineTM2000将ZEB1-WT和ZEB1-MUT组细胞分别转染miR-con和miR-204-5p。依据说明书要求，使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶报告实验测定。实验结果以荧光素酶活性和Renilla活性的比值进行统计学分析，实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-204-5p和ZEB1在人胃癌细胞系中的表达

qRT-PCR检测结果(表1)显示，与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比，胃癌细胞AGS、SGC-7901、MGC-803中miR-204-5p的表达水平显著降低，ZEB1 mRNA的表达水平显著升高(P<0.05)。Western blot检测结果(图1，表1)显示，与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比，胃癌细胞AGS、SGC-7901、MGC-803中ZEB1蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。

2.2 过表达miR-204-5p对胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭、迁移及EMT的影响

qRT-PCR检测结果(表2)显示，与miR-con组相比，miR-204-5p组胃癌细胞中miR-204-5p的表达水平显著升高(P<0.05)。Western blot检测结果(图2B，表3)显示，与miR-con组相比，miR-204-5p组胃癌细胞中MMP-2、Cyclin D1、Vimentin蛋白的表达水平显著降低，E-cadherin蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。MTT法检测结果(表2)显示，与miR-con组相比，miR-204-5p组胃癌细胞活性显著降低(P<0.05)。Transwell 法检测结果(图2A，表2)显示，与miR-con组相比，miR-204-5p组胃癌细胞迁移和侵袭数量显著降低(P<0.05)。

图1 ZEB1蛋白表达

分组miR-204-5pZEB1 mRNAZEB1 蛋白GES-11.01±0.101.02±0.110.24±0.06AGS0.36±0.06①4.22±0.34①0.80±0.04①SGC-79010.27±0.05①5.16±0.41①0.85±0.07①MGC-8030.38±0.03①5.18±0.36①0.87±0.05①F值244.871327.862259.619P值0.0000.0000.000

注：与GES-1组比较，①P<0.05

图2胃癌SGC-7901细胞侵袭、迁移细胞数以及增殖、迁移相关蛋白表达 A：Transwell检测胃癌SGC-7901细胞侵袭、迁移的细胞数；放大倍数200×; B：Western blot检测胃癌SGC-7901细胞增殖相关蛋白和迁移相关蛋白表达

表2 过表达miR-204-5p对胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭、迁移的影响

表3 miR-204-5p模拟物对胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移、EMT相关蛋白表达的影响

2.3 miR-204-5p靶向调控ZEB1的表达

通过TargetScan数据库预测到ZEB1与miR-204-5p存在结合位点(图3A)。荧光素酶报告基因检测实验结果(表4)显示，转染野生型ZEB1基因表达载体ZEB1-WT后，相较于miR-con组，miR-204-5p组ZEB1-WT胃癌细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而转染突变型ZEB1基因表达载体ZEB1-MUT后，相较于miR-con组，miR-204-5p组ZEB1-MUT胃癌细胞的荧光素酶活性差异不显著。Western blot检测结果(图3B，表5)显示，相较于miR-con组，miR-204-5p组胃癌细胞中ZEB1的表达水平显著降低；相较于anti-miR-con组，anti-miR-204-5p组胃癌细胞中ZEB1的表达水平显著升高(P<0.05)。

图3ZEB1的3′UTR中含有与miR-204-5p互补的核苷酸序列

2.4 抑制ZEB1表达对胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭、迁移及EMT的影响

表4 双荧光素酶报告实验

表5 miR-204-5p调控ZEB1蛋白的表达

注：与miR-con组比较，①P<0.05；与anti-miR-con组比较，②P<0.05

Western blot检测结果(图4，表7)显示，与si-con组相比，si-ZEB1组胃癌细胞中ZEB1、MMP-2、Cyclin D1、Vimentin蛋白的表达水平显著降低，E-cadherin蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。MTT法检测结果(表6)显示，与si-con组相比，si-ZEB1组胃癌细胞活性显著降低(P<0.05)。Transwell 法检测结果(图2A，表2)显示，与si-con组相比，si-ZEB1组胃癌细胞迁移和侵袭数量显著降低(P<0.05)。

2.5 过表达ZEB1逆转过表达miR-204-5p对胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭、迁移及EMT的作用

Western blot检测结果(图5，表9)显示，与miR-204-5p+pcDNA组相比，miR-204-5p+pcDNA-ZEB1组胃癌细胞中ZEB1、MMP-2、Cyclin D1、Vimentin蛋白的表达水平显著升高，E-cadherin蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。MTT法检测结果(表8)显示，与miR-204-5p+pcDNA组相比，miR-204-5p+pcDNA-ZEB1组胃癌细胞活性显著升高(P<0.05)。Transwell 法检测结果(表8)显示，与miR-204-5p+pcDNA组相比，miR-204-5p+pcDNA-ZEB1组胃癌细胞迁移和侵袭数量显著升高(P<0.05)。

图4 检测胃癌SGC-7901细胞增殖相关蛋白和迁移相关蛋白表达

分组细胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h细胞侵袭数量细胞迁移数量si-con0.35±0.040.68±0.050.89±0.0767.29±6.98156.29±11.39si-ZEB10.33±0.030.43±0.040.53±0.0633.26±5.0276.22±7.06t值1.20011.71311.71411.87417.925P值0.2480.0000.0000.0000.000

表7 抑制ZEB1表达对胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移及EMT相关蛋白的作用

图5 检测胃癌SGC-7901细胞增殖相关蛋白和迁移相关蛋白表达

分组细胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h细胞侵袭数量细胞迁移数量miR-con0.38±0.040.73±0.070.88±0.0865.59±5.39135.33±11.29miR-204-5p0.36±0.020.42±0.05①0.61±0.07①25.36±3.95①70.37±6.59①miR-204-5p+pcDNA0.35±0.030.41±0.040.60±0.0525.29±3.1968.26±7.02miR-204-5p+ pcDNA-ZEB10.37±0.040.68±0.05②0.79±0.06②62.59±5.22②120.36±8.64②F值1.33389.11339.310220.357144.088P值0.2810.0000.0000.0000.000

注：与miR-con组比较，①P<0.05；与miR-204-5p+pcDNA组比较，②P<0.05

表9 miR-204-5p和ZEB1表达对胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移、EMT相关蛋白的作用

注：与miR-con组比较，①P<0.05；与miR-204-5p+pcDNA组比较，②P<0.05

3 讨论

胃癌是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤，因其异质性强，恶性度高导致预后差，严重影响人类身体和生命健康[7]。侵袭和转移是导致术后易复发和转移的重要原因，研究发现miRNA通过调控胃癌相关的调控基因或mRNA，可导致胃癌细胞的侵袭和转移[8]。如miR-204-5p通过靶向调控Six1可抑制乳腺癌细胞迁移及侵袭[9]；miR-204-5p在结直肠癌组织中下调表达，恢复miR-204-5p表达通过下调RAB22A抑制了结直肠癌的迁移和侵袭[10]；miR-204-5p同样可以通过抑制RAB22A抑制胶质瘤细胞的迁移与侵袭[11]。miR-204-5p还通过抑制FOXC1表达抑制喉鳞状细胞癌的侵袭和转移[12]。本实验研究结果显示，miR-204-5p在胃癌细胞中也低表达，过表达miR-204-5p可抑制S胃癌GC-7901细胞增殖、迁移和侵袭；且miR-204-5p靶向调控ZEB1的表达。

ZEB1是锌指蛋白转录因子家族成员，研究发现ZEB1与肿瘤的发生发展及侵袭和转移过程相关，在肿瘤细胞中高表达会促进肿瘤细胞的迁移能力[13]。ZEB1高表达的胃癌患者会显示出较短的总生存期和无病生存期、较高的淋巴结转移率和远处转移率[14]。miR-431通过抑制ZEB1介导的EMT抑制肝癌细胞的迁移和侵袭[15]。miR-1271也通过靶向ZEB1和TWIST1抑制胰腺癌细胞的迁移，侵袭和EMT[16]。本研究结果显示，胃癌细胞中ZEB1高表达，抑制ZEB1表达可抑制胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭。且ZEB1受miR-204-5p的靶向调控，过表达ZEB1能逆转miR-204-5p对胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移、侵袭的抑制作用。

EMT是上皮细胞转化成有迁移能力的间质细胞的现象，研究发现其与肿瘤的侵袭和转移密切相关[17]。细胞表面蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、细胞骨架蛋白波形蛋白(Vimentin)、转化因子ZEB1等是EMT的相关生物标志物，在EMT过程中，E-cadherin功能丧失，Vimentin及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表达水平上调；Zeb家族的异常高表达经促进EMT而介导肿瘤细胞的侵袭转移[18]。在上皮性卵巢癌中，ZEB1表达增加时，E-cadherin表达下降，而Vimentin表达上升，提示ZEB1可能通过调节上皮性卵巢癌中E-cadherin及Vimentin的表达参与了EMT过程[19]。Vimentin在胃癌中高表达，E-cadherin低表达，其通过EMT参与胃癌淋巴转移[20]。本实验研究结果显示，过表达miR-204-5p和抑制ZEB1表达均抑制MMP-2、Vimentin蛋白的表达，促进E-cadherin蛋白的表达。提示miR-204-5p和ZEB1通过影响Vimentin和E-cadherin表达影响EMT过程进而影响胃癌细胞的迁移和侵袭。

综上所述，miR-204-5p可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与靶向调控ZEB1和EMT有关，将可为胃癌的预防和治疗提供新靶点。