miR-145-5p靶向PLCE1对胰腺癌细胞增殖、分化和凋亡的机制研究

胡松，周文杰，徐天天，张文滔

胰腺癌是一种发病率较高的高度致命性疾病。由于其早期症状不明显，又缺乏有效的早期检测方法，大多数患者就诊时已处于胰腺癌晚期，导致只有少数患者可进行切除手术。因此，寻找鉴定胰腺癌的分子标志物，开发新的有效的治疗方法迫在眉睫。miRNA是一类可参与基因转录后水平调控的短链非编码RNA，在胰腺癌中异常表达miRNA的通过调控其下游基因的表达，参与胰腺癌的发生发展[1-3]。有研究报道miR-145-5p在前列腺癌细胞中呈低表达，过表达miR-145-5p可抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导癌细胞凋亡[4]。此外，miR-145-5p在乳腺癌增殖中也处于较低的表达水平，且miR-145-5p可靶向作用于SOX2发挥生物学作用[5]。前人研究发现，miR-145-5p在胰腺癌患者血浆中表达下调，但miR-145-5p对胰腺癌细胞增殖、分化和凋亡的影响尚未可知[6]。磷脂酶Cε1 (phospholipase C epsilon-1,PLCE1)基因编码的PLCE1蛋白是磷脂酰肌醇信号转导通路中的关键调控酶，参与对细胞生长、分化和凋亡等生命活动的的调控[7]。研究发现[8-9]，PLCE1在食管癌组织中呈高表达，沉默PLCE1可促进食管癌细胞Eca109的自噬和凋亡。然而，PLCE1在胰腺癌中的表达情况，且miR-145-5p能否靶向PLCE1参与对胰腺癌增殖、分化和凋亡的调控尚不清楚。因此，本研究通过检测常胰腺细胞和胰腺癌细胞中miR-145-5p和PLCE1的表达，观察过表达miR-145-5p对胰腺癌细胞增殖、分化和凋亡的影响，探究miR-145-5p对PLCE1的靶向作用机制，以期为胰腺癌的早期诊断和分子靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和主要试剂

胰腺癌细胞PANC-1、SW1990、Capan-1、Capan-2和正常胰腺细胞hTERT-HPNE均购于美国ATCC。高糖DMEM培养基和RPMI-1640培养基购于Thermo公司；FBS购于杭州四季青公司；青链霉素双抗购于HyClone公司；LipofectamineTM2000相关转染试剂和TRIzol试剂购于Invitrogen公司；MTT试剂、DMSO、AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液和Western blot相关试剂均购于上海碧云天生物技术公司；PLCE1、CyclinD1、Bcl-2、SOX2、OCT-4和FOXA2抗体购于Abcam公司；β-actin、Bax抗体购于Santa Cruz公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司。

1.2 细胞培养、转染和分组

hTERT-HPNE细胞用DMEM培养基培养，SW1990、Capan-1和Capan-2细胞用RPMI-1640培养基培养，PANC-1细胞用高糖DMEM培养基进行培养。所有培养基中均含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，并放置于37 ℃、饱和湿度和含5% CO2的细胞培养箱中进行培养。细胞转染：取对数期PANC-1细胞，以每孔2×105个细胞数接种于96孔板，当细胞融合度达到50%时，按照LipofectamineTM2000使用说明书将miR-145-5p、miR-con和NC分别转染PANC-1细胞，置于细胞培养箱常规培养48 h后进行后续实验。为了进一步验证miR-145-5p是通过下调PLCE1表达影响PANC-1细胞的增殖、分化和凋亡，在PANC-1细胞同时转入miR-145-5p模拟物和pcDNA-PLCE1，检测过表达PLCE1能否逆转miR-145-5p对PANC-1细胞增殖、分化和凋亡的影响。实验分组如下：NC组(空白对照)、miR-con组(阴性对照)、miR-145-5p组(转染miR-145-5p)、miR-145-5p+pcDNA-con组(miR-145-5p和pcDNA-con共转染)和miR-145-5p+pcDNA-PLCE1组(miR-145-5p和pcDNA-PLCE1共转染)。

1.3 qRT-PCR检测

依照TRIzol试剂使用说明分别提取hTERT-HPNE、SW1990、Capan-1、Capan-2和各组PANC-1细胞的总RNA，用Nanodrop 2000检测其浓度和纯度。利用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，并以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。分别以以U6和β-actin为内参，用2-ΔΔCt法计算miR-145-5p和PLCE1 mRNA的相对表达量。实验所用引物序列如下：miR-145-5p-F：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；miR-145-5p-R：5′-AGGTCCAGTTTTCCCAGG-3′；U6-F：5′-GCTTCGGCAGCACA-TATACTAAAAT-3′；U6-R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-CAT-3′；PLCE1-F：5′-GAGCTGCAATCGAAGTCTGG-3′；PLCE1-R：5′-AAGGCCTTCTGTGAGTCCTC-3′；β-actin-F：5′-CTCCA-TCCTGGCCTCGCTGT-3′；β-actin-R：5′-GCTGTCACCTTCACC-GTTCC-3′。

1.4 MTT法检测细胞增殖活力

分别于转染后0 h、24 h、48 h和72 h各取一组PANC-1细胞，加入20 μL/孔的MTT试剂在培养箱中孵育约4 h，小心吸去孔内上清后，再加入150 μL/孔的DMSO试剂继续孵育2 h至结晶完全溶解。利用酶联免疫吸附仪，在490 nm波长，测量各孔的OD值(用空白孔进行调零)。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

用胰酶(不含EDTA)消化处理各组PANC-1细胞，将各组PANC-1细胞转移至EP管中，1 000 rpm离心5 min，然后收集细胞。用预冷的PBS漂洗细胞2次，离心弃去上清液。用100 μL的1×的结合缓冲液重悬细胞，然后分别加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI进行染色并混匀，避光室温孵育15 min，测试前补加400 μL的1×结合缓冲液后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 Western blot检测增殖、分化、和凋亡相关蛋白的表达

采用RIPA裂解液裂解各组PANC-1细胞，收集各组细胞总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白样品沸水浴3～5 min充分变性后，取30 μg已冷却至室温的变性蛋白上样到SDS-PAGE胶加样孔，设置参数，进行电泳。电泳结束后，利用转膜装置将已分离的细胞蛋白从PAGE胶转移至PVDF膜，转膜结束后，用Western blot洗涤液漂洗1～2 min，然后用Western blot封闭液侧摆摇床室温封闭60 min，吸尽封闭液后立即加入已稀释的抗PLCE1、β-actin、CyclinD1、Bax、Bcl-2、SOX2、OCT-4和FOXA2蛋白的一抗(1∶1 000)，室温孵育2 h后，回收一抗后，将已漂洗后的PVDF膜中加入已稀释的二抗(1∶500)，室温孵育1 h，回收二抗后，用Western blot洗涤液进行洗膜，共洗3次，每次5 min，然后进行ECL显色、洗片，并以β-actin为内参对目的条带灰度值进行分析。

1.7 双荧光素酶报告基因检测

利用靶基因预测数据库Target Scan网站(http://www.targetscan.org)预测miR-145-5p的靶基因。发现miR-145-5p的5′端可与PLCE1 mRNA的3′-UTR区域特异性结合，猜测PLCE1是miR-145-5p的靶基因。为验证这一猜想，构建含有miR-145-5p结合位点的PLCE1-3′UTR野生型(WT-PLCE1)及突变型(MUT-PLCE1)荧光素酶报告基因载体。利用LipofectamineTM2000将miR-145-5p和miR-con分别与WT-MDM2和MUT-MDM2共转染PANC-1细胞，然后将各组PANC-1细胞于细胞培养箱内培养48 h，收集各组细胞，并利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组PANC-1细胞的荧光素酶活性。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 miR-145-5p和PLCE1在正常胰腺细胞和胰腺癌细胞中的表达

表1和图1结果显示，与hTERT-HPNE细胞相比，PANC-1、SW1990、Capan-1和Capan-2细胞中miR-145-5p的表达显著降低，PLCE1 mRNA和PLCE1蛋白的表达显著升高(P<0.05)。表明，在胰腺癌细胞中miR-145-5p呈低表达，PLCE1呈高表达。

图1 Western blot检测PLCE1蛋白表达

2.2 过表达miR-145-5p对胰腺癌细胞PANC-1增殖和分化的影响

表2结果显示，与NC组和miR-con组比较，miR-145-5p组PANC-1细胞中miR-145-5p的表达显著升高(P<0.05)。表明成功构建了过表达miR-145-5p的PANC-1细胞株。图2、表2和表3结果显示，与NC组和miR-con组比较，miR-145-5p组PANC-1细胞在0 h和24 h时的细胞活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h时细胞活力显著减弱，CyclinD1、SOX2和OCT-4蛋白的表达显著降低，FOXA2蛋白的表达显著升高(P<0.05)。表明，过表达miR-145-5p可抑制胰腺癌细胞的增殖，促进胰腺癌细胞的分化。

表1 用检测胰腺癌细胞和正常胰腺细胞系中miR-145-5p、PLCE1表达量

注：与hTERT-HPNE细胞组比较，*P<0.05

图2Western blot检测CyclinD1 SOX2、OCT-4、FOXA2蛋白的表达

表2 高表达miR-145-5p对PANC-1胰腺癌细胞系增殖的影响

注：与miR-145-5p组比较，*P<0.05

表3 Western blot检测SOX2、OCT-4、FOXA2蛋白表达

注：与miR-145-5p组比较，*P<0.05

2.3 过表达miR-145-5p对胰腺癌细胞PANC-1凋亡的影响

图3和表4结果显示，与NC组和miR-con组比较，miR-145-5p组PANC-1细胞的凋亡率显著增加，Bax蛋白的表达显著增加，Bcl-2蛋白的表达显著减少(P<0.05)。表明，过表达miR-145-5p可促进胰腺癌细胞的凋亡。

2.4 miR-145-5p靶向调控PLCE1表达

图4A显示，miR-145-5p的5′端可与WT-PLCE1 mRNA的3′UTR区域存在特异性结合位点。表5结果显示，野生型PLCE1基因荧光素酶表达载体WT-PLCE1和miR-145-5p模拟物共转染PANC-1细胞后，miR-145-5p组PANC-1细胞荧光素酶活性较miR-con组明显降低(P<0.05)；而突变型PLCE1基因荧光素酶表达载体MUT-PLCE1和miR-145-5p模拟物共转染PANC-1细胞后，miR-145-5p组PANC-1细胞荧光素酶活性较miR-con组差异不显著(P>0.05)。表6和图4B结果显示，与miR-con组比较，miR-145-5p组PANC-1细胞PLCE1蛋白的表达量显著减低；与anti-miR-con组比较，anti-miR-145-5p组PANC-1细胞PLCE1蛋白的表达量显著升高(P<0.05)。提示，PLCE1是miR-145-5p的靶基因，miR-145-5p可负性调控PLCE1的表达。

图3高表达miR-145-5p对胰腺癌细胞系PANC-1凋亡的影响研究 A：流式细胞仪检测细胞凋亡；B：Western blot检测Bax、Bcl-2的蛋白

表4 高表达miR-145-5p对胰腺癌细胞系PANC-1凋亡的影响研究

注：与miR-145-5p组比较，*P<0.05

图4miR-145-5p靶向调控PLCE1表达 A：通过TargetScan对miR-145-5p和PLCE1结合进行预测示意图；B：Western blot检测PLCE1蛋白表达

表5 miR-con或miR-145-5p与报告质粒共转染PANC-1细胞后双荧光素酶活性检测

注：与miR-con组比较，*P<0.05

2.5 过表达PLCE1可部分恢复过表达miR-145-5p对PANC-1细胞增殖、分化和凋亡的影响

图5、表7和表8结果显示，与miR-con组相比，miR-145-5p组PANC-1细胞在0 h和24 h时的细胞活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h时细胞活力显著减弱，细胞的凋亡率显著增加，PLCE1、Bcl-2、CyclinD1、SOX2和OCT-4蛋白的表达显著降低，Bax和FOXA2蛋白的表达显著升高(P<0.05)；与miR-145-5p+pcDNA-con组相比，miR-145-5p+pcDNA-

表6 Western Blot检测PLCE1的表达

注：与miR-con比较，*P<0.05；与anti-miR-con组比较，#P<0.05

PLCE1组PANC-1细胞在0 h和24 h时的细胞活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h时细胞活力显著增强，细胞的凋亡率显著降低，PLCE1、Bcl-2、CyclinD1、SOX2和OCT-4蛋白的表达显著升高，Bax和FOXA2蛋白的表达显著降低(P<0.05)。以上结果表明，过表达PLCE1可部分逆转过表达miR-145-5p对胰腺癌细胞增殖抑制、分化和凋亡促进作用。

图5过表达PLCE1部分恢复miR-145-5p高表达对胰腺癌细胞系PANC-1分化、增殖、凋亡的影响 A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B Western Blot检测PLCE1、Bax、Bcl-2、CyclinD1、SOX2、OCT-4、FOXA2蛋白表达

表7 WB检测PLCE1、Bax、Bcl-2、SOX2、OCT-4、FOXA2 相关蛋白的表达

注：与miR-con组比较，*P<0.05；与miR-145-5p+pcDNA-con组比较，#P<0.05

表8 过表达PLCE1部分恢复过表达miR-145-5p对胰腺癌细胞系PANC-1增殖、凋亡的影响

注：与miR-con组比较，*P<0.05；与miR-145-5p+pcDNA-con组比较，#P<0.05

3 讨论

近年来，越来越多的研究证实，miRNA通过调控其下游靶基因而发挥癌基因或抑癌基因的作用，miRNA的异常表达与人类多种癌症的发病机制和进展密切相关[10]。其中，miR-145在多种恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用。例如，miR-145通过靶向MUC1下调E-cad表达，从而抑制肿瘤的侵袭转移[11]；miR-145-5p通过靶向TAGLN2抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移[12]。此外，miR-145-5p还可通过靶向下调KLF5促进胃癌分化[13]。但miR-145-5p对对胰腺癌细胞增殖、分化和凋亡的影响尚未可知。本研究首先对正常胰腺细胞和4种胰腺癌细胞中miR-145-5p的表达情况进行检测，发现胰腺癌细胞中miR-145-5p的表达显著下调，这与杨立涛等人[6]的研究结果相吻合，推测miR-145-5p与胰腺癌细胞的增殖、分化和凋亡有关。随后以胰腺癌细胞PANC-1为研究对象，成功构建过表达miR-145-5p的胰腺癌细胞株，发现PANC-1细胞的增殖活力显著减弱，凋亡率显著增加。SOX-2(Y染色体上的性别决定区盒2)、OCT-4(八聚体结合转录因子4)和FOXA-2(叉头样转录因子A2)是反映癌细胞分化程度的常用指标[14]。有研究[15]报道，SOX-2和OCT-4蛋白在癌旁组织和良性肿瘤中不表达，与高分化肿瘤相比，低分化肿瘤中更易检测到高度表达的SOX-2和OCT-4蛋白。FOXA-2高表达则可通过提高组蛋白乙酰化水平进而诱导干细胞向多巴胺能神经元分化[16]。本研究将SOX-2、OCT-4和FOXA-2作为反映胰腺癌分化程度的指标，发现，过表达miR-145-5p可抑制SOX-2和OCT-4蛋白的表达，促进FOXA-2蛋白的表达。提示，过表达miR-145-5p可诱导胰腺癌细胞的分化和凋亡，抑制细胞增殖。

PLCE1基因位于10号染色体q23.32～24.1位置，其编码的PLCE1蛋白属于磷脂酶C家族，即可被上游信号Ras家族GTP酶和G蛋白进行双向调节，还可引起钙离子流动、激活蛋白激酶C和作为GMP交换因子，参与对细胞增殖、分化和侵袭等生物学过程的调控[17]。虽然对PLCE1已进行广泛的研究，但其在人类癌症中的作用仍存在争议。在结直肠癌、肺癌和皮肤癌等Ras引发的癌症中PLCE1呈低表达，并发挥抑癌作用[18]。然而，在膀胱癌和食管癌等癌症中PLCE1具有癌基因的作用，干扰PLCE1表达降低了膀胱癌T24细胞株的侵袭能力,miR-145通过靶向下调PLCE1抑制食管鳞癌的肿瘤增殖和转移[19-20]。但其在胰腺癌中的生物学功能还有待进一步阐明。本研究发现，与正常胰腺细胞相比，4种胰腺癌细胞中PLCE1的表达显著上调。此外，本研究首次用双荧光素酶报告基因和Western blot检测发现miR-145-5p通过靶向下调PLCE1表达与胰腺癌细胞的增殖、分化和凋亡有关。为了进一步验证miR-145-5p通过靶向PLCE1参与对胰腺癌细胞的增殖、分化和凋亡的调控，进行功能回复实验发现，过表达PLCE1可逆转miR-145-5p对胰腺癌细胞增殖抑制、分化和凋亡促进作用。提示，miR-145-5p是通过调控PLCE1表达发挥作用，因此推断miR-145-5p通过靶向下调PLCE1抑制胰腺癌细胞的增殖，诱导细胞分化和凋亡，遏制胰腺癌的恶性发展。

综上所述，miR-145-5p在胰腺癌细胞中呈低表达，PLCE1呈高表达，上调miR-145-5p通过靶向下调PLCE1可抑制胰腺癌细胞的增殖，诱导细胞分化和凋亡。因此，miR-145-5p有望成为胰腺癌早期诊断和分子治疗的潜在靶点。