一种侧流试纸结合FAM重组酶聚合酶扩增(RPA)诊断布鲁氏菌感染的方法

葛志毅，周建华，尚佑军，李学瑞，刘永生，赵 鹭，孙晶晶，曹小安

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏杆菌(Brucella)引起的细菌性人兽共患病，有急性，亚急性和慢性几种形式[1]。其病原布鲁氏菌为革兰氏阴性兼性细胞内寄生菌[2]，可由口、鼻、咽喉、结膜等途径侵害易感动物，造成妊娠母畜流产、死胎，及公畜睾丸炎等主要症状，同时伴有发热、关节疼痛、淋巴结肿大等症状，对养殖业发展造成了巨大经济损失。同时作为一种典型的人兽共患病，对人类的健康也存在着极大的威胁[3]。

目前实验室布鲁氏菌病主要诊断技术为血清学检测和PCR检测，血清学检测由于抗原蛋白分离纯化的不同，其检测抗体不同，易与其他检测结果出现分歧[4]；PCR 检测是目前有效的检测方法，已经发展出多种PCR检测方法，如多重PCR、实时荧光定量PCR等，具备特异性高、检测快速等优点，但是由于各种PCR结果判断标准的不同，还是存在着一定的误差。本实验所研究的方法为布病检测提供了新的方法，增加了检测的多样性，同时该方法只需要在恒温器中加入基因组短暂扩增后，取扩增产物在侧流试纸上进行检测即可。该方法相比于传统RPA扩增产物荧光检测而言[5]，更加方便，使得野外田间检测成为一种可能。

1 材料与方法

1.1实验试剂及仪器 试剂：RPA引物探针，Rehydration Buffer，RNase Inhibitor的dH2O，乙酸镁，5×Extration Buffer，TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0。侧流试纸购自ABINGDON HEALTH公司，其商品名为Nucleic Acid Detection-Nucleic Acid Detection-PCRD。仪器：恒温扩增仪、单道移液器、涡旋器，小型离心机。

1.2基因组提取 基因组提取参照TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂说明书提取，主要原理是对组织进行研磨裂解，利用无水乙醇，Buffer RWA和Buffer RWB洗脱去除杂质，离心洗脱DNA。其中特异性实验中细菌基因组提取不需要组织研磨，只需将菌液离心后按照后续步骤继续提取即可，同时标准布鲁氏杆菌基因组为实验室保存的M5基因。具体方法参考试剂说明书。

1.3引物与探针 根据布鲁氏杆菌的特异基因为omp25(Accession:AY484523.1)保守序列设计引物与探针，具体见表1。

表1 针对布鲁氏杆菌特异基因的保守序列设计的引物与探针
Tab.1 Primers and probes designed for conserved sequences of Brucella-specific genes

引物/探针名称 引物/探针序列RPAFggtgttgaaggtgatgcaggttattcctgggccaaRPARbiotin-ccgcaataccagccgtgaggtacggcataacRPA-oligoFAM-ggcctggaagtcaagcagggctttgaaggctc(THF)ct-gcgtgcccgcgtcgg-C3space

1.4RPA侧流试纸反应条件的优化 RPA加样体系：上、下游引物(10 μmol/L)各2.1 μL，RPA探针(10 μmol/L)0.6 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，RNase Inhibitor的dH2O 11.2 μL，DNA样本2 μL，混合后加入RPA酶管中震荡混匀，再加入2.5 μL的乙酸镁在加热器上反应，反应后取扩增产物侧流试纸检测。

1.4.1最佳反应温度确定 加样完成后，分别取标准阳性M5和沙门作为阴性的样品在36 ℃、38 ℃、40 ℃ 3个温度条件下反应，反应时间为常规标准的10 min,反应后取扩增产物侧流试纸检测。

1.4.2最佳反应时间确定 同样加样完成后，分别取标准阳性M5和沙门作为阴性的样品在5～30 min范围内反应，(阳性分别设置5 min、10 min、20 min 3个时间梯度，阴性分别设置10 min、20 min、30 min 3个时间梯度)，反应温度为常规温度38 ℃[6]，反应后取扩增产物侧流试纸检测。

侧流试纸检测加样体系为：取6 μL扩增产物，加入84 μL的5×Extration Buffer,充分混匀后，取75 μL滴至侧流试纸反应孔中，10 min内读取结果。

1.5特异性实验 分别用沙门氏菌、大肠杆菌、衣原体、肠球菌、金色葡萄球菌以同样基因组提取试剂盒以同样的方法提取基因组，加入体系以最优反应条件扩增，反应结束后用侧流试纸检测，验证引物与探针的特异性。

1.6敏感性实验 用布鲁氏杆菌的M5基因组作为RPA的标准品，以10倍的梯度稀释，加入体系以最优反应条件扩增，反应结束后用侧流试纸检测，来验证引物与探针的敏感性，布鲁氏杆菌的M5基因组的初始浓度为4×104基因拷贝/μL(通过QPCR定量获得)[7]，阴性对照为沙门氏菌基因组。

1.7临床验证 检测104份样品，37份为绵羊乳汁提取DNA，67份为羊组织提取DNA，经过QPCR检测，63个阳性，41个阴性(扩增没有Cq值)，用RPA侧流试纸进行检测，验证其与QPCR检测结果的符合率。

2 结 果

2.1 RPA侧流试纸反应条件的优化

2.1.1最佳反应温度的确定 按照上述方法进行检测，侧流试纸结果表明M5阳性样品在36 ℃就能出现阳性条带，38 ℃时阳性条带很明显，40 ℃同样明显。而阴性样品检测结果显示在36 ℃，38 ℃条件下只出现质控带，不出现任何阳性条带，但是在40 ℃条件下，会出现一条很弱很弱的阳性条带。实验结果如图1所示。

In the test results from top to bottom on the left is the M5,36℃,38℃,and 40℃; From top to bottom on the right is a salmonella 36℃,38℃,and 40℃.图1 最佳反应温度实验侧流试纸检测结果Fig.1 Lateral flow test strips detect results of the optimal reaction temperature experiment

综合考虑，为了充分保证实验特异性，避免假阳性出现，以38 ℃为最佳反应温度。为了进一步说明实验结果的真实性，对不同温度的RPA扩增产物进行核酸电泳，其结果与侧流试纸结果一致，在100～200 bp之间，阳性38 ℃和40 ℃有一条很明显条带，阴性40 ℃有一条很浅的条带。实验结果如图2所示。

Note:From left to right is the Mark,M5 36℃,38℃,and 40℃, salmonella 36℃, 38℃,and 40℃.图2 最佳反应温度实验核酸电泳结果Fig.2 Nucleic acid electrophoresis detect results of optimum reaction temperature experiment

2.1.2最佳反应时间的确定 同样按照上述方法进行检测，侧流试纸结果表明M5阳性样品在10 min就能出现明显阳性条带，20 min同样如此。阴性样品检测结果显示在10 min内只出现质控带，而20 min和30 min时有一条很弱的阳性条带。综合考虑，还是以最大程度保证特异性为主，避免假阳性的存在，以反应时间10 min作为最佳反应时间。同样用核酸PCR检测扩增产物进行佐证，其结果与侧流试纸检测结果一致，结果如图3所示。因此，本实验为了确保最大程度检测出阳性样品，同时避免阴性样品出现假阳性情况，将反应条件38 ℃ 10 min作为最佳反应条件。

Note:From left to right is the Mark,M5 5 min,10 min, and 20 min, salmonella 10 min, 20 min, and 30 min.图3 最佳反应时间实验核酸电泳检测结果Fig.3 Nucleic acid electrophoresis detect results of optimum reaction time experiment

2.2特异性实验 特异性实验结果表明：滴加至侧流试纸10 min内，只有M5阳性出现明显阳性条带，其他菌株及阴性均只出现质控条带，证明引物和探针存在高度特异性。同样对其扩增产物进行核酸电泳，结果与侧向流动试纸检测结果一致。

2.3敏感性实验 敏感性实验结果表明：将标准DNA稀释到10-4后(80个基因拷贝数)，侧流试纸仍有一条可见阳性带，而到了10-5后(8个基因拷贝数)，阳性条带已经很弱，所以其敏感性以达到10-4(80个基因拷贝数)为准，存在良好的敏感性。同样扩增产物电泳，结果与侧向流动试纸检测结果一致。

2.4临床验证 用QPCR检测了104个不同样品，63个阳性，41个阴性(扩增没有Cq值)，部分检测结果如图4所示。

图4 QPCR部分检测样品结果Fig.4 Partial results of QPCR detection of samples

对这些样品进行RPA扩增，侧流试纸进行检测，其检测结果为75个阳性，29个阴性，总的检测结果统计如表2所示。

可知QPCR检测出63份阳性，41份阴性；RPA检测出75份阳性，29份阴性，即所有样品中63份两种方法检测结果都为阳性，29份两种检测方法结果都为阴性，但部分QPCR检测为阴性的样本RPA检测结果为阳性，RPA对临床样本的检查更加敏感。

表2 两种方法检测结果统计
Tab.2 Test results of the two methods

样本类型QPCRRPA阳性阴性阳性阴性绵羊乳汁2413316羊组织39284423

3 讨 论

布鲁氏菌病一直以来对我国的养羊业、养牛业造成很大的经济损失，同时其作为一种重要的人兽共患病，严重威胁着牧民、养殖户以及相关科研工作人员的健康安全。对其检测和防控一直以来是一个主要的课题，目前，实验室布鲁氏病主要检测诊断技术为血清学检测和PCR检测，两种检测方法各有优缺点。本实验所研究的方法为布病检测提供了新的方法，增加了检测的多样性。

本实验旨在提供一种新的布病快速检测方法，同时为野外田间检测提供一种可能，通过反应体系条件优化，特异性实验，敏感性实验以及与临床QPCR检测比较，最终确定该方法。平时只需要配置好RPA扩增体系，分装到小管中，检测时只需加入样本DNA和醋酸镁，恒温器38 ℃反应10 min后，混入侧流试纸体系中，取适量加入侧流试纸读取结果即可，这为田间检测提供了一种可能。

本实验在不同反应温度、不同反应时间内判断最佳反应结果，设计特异性，敏感性实验及临床验证实验，最终确定该方法。需要指出的是，加样体系是目前最常规的加样体系，对实验结果不会有太大影响，无需过多调整，最主要的是反应体系调整，反应时间和温度的不同往往会影响到实验的结果，出现假阳性的情况，所以确定一个最适的反应条件至关重要。本实验确定最佳反应时间和最佳反应温度时，是以考虑最大程度保证阳性样本的检出，同时避免假阳性的出现为准，因此本实验具有很强的特异性，但是同时也造成敏感性不是特别高，同时检测样品时有出现漏检的情况，因此可以根据实际情况调整反应条件，同时注意样品体系的充分混匀。

本方法特异性强，操作简单、快速、不过多依赖实验仪器，提供了一种新的布病快速检测方法，同时为田间布病检测提供一种可能，但是实验规程标准化方面还需要进一步完善。

利益冲突：无