高血压大鼠心肌2型小电导-Ca2+-激活-K+通道蛋白(SK2)表达的变化*

张雯斐， 杨昌振， 胡鹏程， 陈 浩， 席 悦， 樊红琨， 章 茜， 杨 春△

(1. 郑州大学临床医学系， 河南 郑州 450000； 2. 郑州大学基础医学院生理学与神经生物学系， 河南 郑州 450000)

高血压是最常见的心血管病 ,是全球范围内的重大公共卫生问题，目前尚是人类无法解决的疾病之一。高血压可引起机体许多器官产生疾病,其中以脑卒中和心肌梗死最常见[1]。2型小电导-Ca2+-激活-K+(2-type small conductance-Ca2+-activating-K+SK2)通道是哺乳动物细胞中一种非电压依赖性钾通道，SK2通道激活，K+外流，参与心肌细胞动作电位复极化过程[2]。而高血压是否引起心肌SK2通道表达变化未见报道。本研究用腹腔注射N’-硝基-L-精氨酸(N’-nitro-L-arginine L-NNA)的方法制备大鼠高血压模型[3]，检测心肌SK2通道蛋白的表达，探究SK2在高血压引起心脏结构功能变化的作用，为高血压药物靶向治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

L-NNA试剂购自美国Sigma公司；兔多克隆SK2抗体购自以色列Alamone labs 试剂公司;辣根过氧化酶山羊抗兔lgG、蛋白预染Marker和ECL化学发光试剂购自中国北京康为公司;BCA (一种稳定的水溶性复合物，可与Cu+结合生成紫色复合物)蛋白浓度测定试剂盒购自中国碧云天生物技术研究所。

1.2 分组与建立高血压动物模型

健康雄性成年SD 大鼠购自河南省实验动物中心(生产许可证 SCXK(豫)2011- 0012，)使用许可证 SYXK(豫)2011-0012)，体重200 ～220 g。经心电图检测正常后将动物随机分为对照组(n=5)和实验组(n=7)。(原分组既定各5只大鼠，因担心实验建模过程中实验组大鼠死亡，故多备两只大鼠，后来大鼠全部存活，故实验组比对照组多两只)实验组大鼠用L-NNA 15 mg/( kg·d ) 腹腔注射，连续应用28 d，对照组腹腔注射等积生理盐水。动物单独饲养于通风暗室房间，以日光灯控制光照周期(12 h:12 h)，室温保持在 22～24℃，饲以普通饲料购自河南实验动物中心和饮用水。

1.3 大鼠血压的监测

尾套法血压测量：将大鼠置于固定盒中，并用尾套置于鼠尾根部，脉搏传感器传感片紧贴鼠尾下方，然后将鼠尾及尾套预热，同时等待大鼠安静，待脉搏稳定之后，使用球囊打气加压直至脉搏波呈直线，缓慢放气，待脉搏波动出现时，此时测量的尾套内气体压力值，即鼠尾动脉压(arterial blood pressure, BP)[4]。

1.4 大鼠心电图测量

大鼠经体积分数10%水合氯醛麻醉(4 ml/kg体重)后固定于鼠板上，将针形电极刺入四肢皮下，采用Rm6240型多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)连续记录Ⅱ导联心电图，测量P波时长、P-R间期、QRS时长、R-R间期。每只大鼠给药前称重并记录四肢导联心电图，给药后每周测量一次心电图。4周末给大鼠称重并记录心电图后处死。

1.5 大鼠心脏取材

给药第4周末，大鼠测量心电图后，用10% 水合氯醛腹腔注射麻醉(4 ml/kg体重)，暴露心脏，快速取出心脏。通过大鼠症状表现、血压变化、心电图判断模型制备是否成功，制备成功的大鼠取出心脏后放入液氮中，提取心脏组织蛋白做 Western blot。

1.6 Western blot 的检测

以1∶9的比例在心脏中加入组织匀浆液制备蛋白样品，提取的蛋白样品加入5×loading buffer，99℃煮沸5 min，100 g/L SDS-PAGE分离胶上样后100 V电泳3 h；取下凝胶，4℃恒压(100 V)电转2 h。取下PVDF膜(Bio-Rad公司)，50 g/L脱脂牛奶-TBS室温封闭1 h，随即加入兔多克隆抗SK2抗体(按1∶150稀释，Sigma公司)4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(按1∶5 000稀释，Thermo公司)室温孵育2 h，TBST漂洗，ECL化学发光曝光显影[5]。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 两组大鼠体重的比较

给药前实验组大鼠体重为(210±11)g，对照组为(205±10)g，两组体重差异无显著性。给药四周末称重，实验组大鼠体重增加较少，均值为(390±21)g，对照组大鼠体重(403±19)g，增加较多，两组无显著性差异。

2.2 高血压模型大鼠症状的表现

与对照组大鼠相比，给药第2周开始部分实验组大鼠出现毛色发黄，无光泽，呼吸频率加快，烦躁不安，口唇发绀，尿少，尿黄等症状。给药第4周所有实验组大鼠均出现上述症状。

2.3 两组大鼠血压的比较

给药前分别给12只大鼠测血压，对照组和实验组血压如表1显示，两组之间无显著性差异。给药后1、2、3、4周分别检测各组大鼠血压，结果显示，与给药前相比，对照组血压变化无显著性差异(P<0.05)；第3、4周实验组大鼠血压明显高于对照组(P<0.05)。

2.4 两组大鼠心电图的比较

结果显示给药前12只大鼠心电图结果均在正常范围内(图1A)。与给药前比较，从第1周到第4周对照组大鼠心电图均无明显变化(图1B)，而实验组大鼠在第2周有1只大鼠心电图出现变化，有2只在第3周出现变化，到第4周心电图均出现不同程度的变化(图1C)，心电图测量结果显示高血压大鼠QRS时长和R-R间期延长，并有不同程度的ST段抬高或T波高耸(表2)。

Tab. 1 The blood pressure between two groups(mmHg,

*P<0.05vscontrol group

Tab. 2 The results of ECG(ms,

ECG: Electrocardiogram

*P<0.05vscontrol group

Fig.1Electrocardiogram(ECG) in control group and experimental group

A: Before the experiment; B: Control group before execution at 4 weeks; C: Experimental group before execution 4 weeks

2.5 两组大鼠心肌SK2通道蛋白的表达水平的比较

如图2显示，4周后对照组和实验组的大鼠心肌组织均在约 60 KD处有印迹条带(图2)。与对照组相比，实验组大鼠心房组织和心室组织SK2通道的表达均明显升高(P<0.05)。

Fig.2The expression of small conductance Ca2+-activated-K+channel subtype 2 proteins(SK2) in the hypertensive rats

A: Atria of control group; B: Atria of experimental group; C: Ventricle of control group; D: Ventricle of experimental group

GroupnAtriaVentricleControl group50.52±0.090.99±0.22Experimental group71.12±0.18∗1.64±0.26∗

*P<0.05vscontrol group

3 讨论

本实验采用腹腔注射L-NNA导致一氧化氮缺乏的方法制备高血压动物模型。 NO是一种很强的舒血管物质，能降低全身平均动脉血压，控制全身各种血管床的静息张力，增加肾血流量等，一旦其功能异常则可引起高血压等一系列心血管的病理改变。现已证实，心肌和心内膜细胞中均含有NO，心脏内产生的NO对心脏功能有重要的调节作用[6]。而L-NNA是NO合酶抑制剂,可以抑制NO的合成。本实验利用此方法制备高血压大鼠模型，与对照组相比，给药3周后实验组大鼠血压升高且具有显著性差异,说明该模型大鼠符合高血压大鼠疾病模型条件。

高血压引起心肌细胞Ca2+超载是高压力负荷致心肌舒缩功能障碍的重要病理生理机制。肌质网钙泵(calcium pump of Sarcoplasmic reticulum SERCA)调节Ca2+的释放、摄取与储存,心肌细胞兴奋时,细胞外Ca2+通过钙通道进入细胞内,诱发肌质网释放Ca2+,细胞内Ca2+大于或等于10-5mol/L时,Ca2+与心肌肌钙蛋白结合,使心肌细胞收缩。心肌细胞收缩末期,启动肌质网上的钙泵,摄取细胞内钙储存于肌质网内,使游离Ca2+下降,心肌舒张。有研究发现[7]，钙超载导致的血管功能异常是高血压的发病基础，也是诱发高血压并发症的一个重要因素。

SK2 通道是哺乳动物细胞中一种非电压依赖性钾通道，存在于心肌细胞上,其中SK2亚型主要表达在心房[8]，对细胞内Ca2+浓度的改变具有很强的亲合性，当胞浆中的Ca2+浓度升高时，通过Ca2+与钙调蛋白连接诱导构象改变，SK2通道激活，K+外流，参与心肌细胞动作电位复极化过程[9]，尤其发生于动作电位复极晚期，此期相当于心肌细胞兴奋性的相对不应期和超常期，而临床发生的心律失常多见于此期，本实验提取高血压模型大鼠心肌组织，通过Western blot方法测定高血压模型大鼠心肌组织 SK2 通道蛋白的表达，结果显示心房组织和心室组织SK2 表达显著高于对照组，提示高血压心肌细胞内钙失衡影响SK2通道蛋白表达情况进而对心脏结构功能产生影响。细胞内Ca2+浓度的改变引起钙调蛋白、蛋白激酶或蛋白磷酸化酶的改变，而这些物质均可以调节SK2通道的功能和表达，从而引起心肌内SK2通道表达量的变化。

心电图测量结果显示高血压大鼠QRS时长和R-R间期延长，提示其可能有心室肥厚和缓慢性心律失常，可以提示高血压大鼠SK2通道蛋白表达升高可引起心肌功能的变化[10]，从而导致或者诱发心律失常，本实验结果提示SK2通道蛋白表达异常可引起心肌功能的变化，可能是导致高血压模型大鼠出现心律失常的机制之一。对SK2通道的深入研究有助于进一步揭示其在高血压疾病中的作用机制，为高血压疾病的治疗和预后提供新的思路和策略，但其具体作用机制尚需进一步的研究。