鞘氨醇激酶1和1-磷酸鞘氨醇受体2在癫痫大鼠海马组织中表达的变化*

董媛媛， 王 琳， 褚 旭， 崔 帅， 孔庆霞△

(1. 山东大学 齐鲁医学院， 济南 250012， 2. 济宁医学院附属医院神经内科， 济宁 272000， 3. 潍坊医学院， 潍坊 261053)

癫痫(epilepsy)是由于脑部神经元异常放电引起的短暂性脑功能障碍的神经系统疾病，具有发作性、短暂性、刻板性的临床特点[1]。癫痫的发病机制非常复杂，至今尚未完全明确。研究表明，癫痫的发生不仅与神经元信号通路失调有关,胶质细胞功能失调也是癫痫发生的重要原因[2]。

鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SphK1)在人体中广泛分布，是将鞘氨醇磷酸化为(sphingosine-1-phosphate，S1P)的关键酶，参与多种细胞功能的调节。5种同源G蛋白偶联受体(S1PRs)介导S1P多种生理性作用。SphK1及其上下游信号分子组成的SphK1/S1P信号通路参与了神经发育，细胞增殖、分化和迁移，学习记忆等正常生理活动[3,4]。研究发现，SphK1和1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2,S1PR2)与神经元的兴奋性调节和星形胶质细胞(astrocyte, AST)活化增生密切相关[5]。SphK1在匹罗卡品致痫小鼠0 h、0.5 h明显下降，4 h有所回升[6]，而在红藻氨酸点燃小鼠模型发现SphK1在致痫后48 h明显升高[7]，但尚不清楚SphK1和S1PR2从急性期到慢性期的动态表达变化及在AST中的表达情况。本研究运用Li-PILO建立癫痫大鼠模型分析SphK1、S1PR2在海马组织中的表达变化及在AST中的表达，探讨其在癫痫发病中可能的机制，为癫痫的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

氯化锂、阿托品、匹罗卡品(美国Sigma公司)；小鼠单克隆SphK1一抗、小鼠单克隆S1PR2一抗(美国Santa Cruz 公司 )；兔多克隆GFAP一抗、驴抗兔Alexa Fluor®488、羊抗小鼠Alexa Fluor®568二抗(美国Abcam公司)；兔多克隆β-actin一抗、HRP标记的羊抗小鼠和羊抗兔二抗、RIPA裂解液(北京鼎国昌盛有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；ECL发光液(美国Millipore公司)；Image Quant LAS 500生物分子成像仪(美国GE公司)；LSM800 共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)。

1.2 动物

SPF清洁级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠108只，体重(230±10)g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(许可证号：SCXK鲁20140007)。

1.3 实验设计

SD大鼠按照随机数字表法随机分为Control组(n=48)和PILO组(n=60)，PILO组进行造模处理，根据造模后观察时间和行为学改变，随机分为3个大组，6个亚组：急性期组(E6 h、E1 d、E3 d)，潜伏期组(E7 d)和慢性期组(E30 d、E56 d)，保证每个亚组中对照大鼠和癫痫大鼠各8只。PILO组经腹腔注射氯化锂127 mg/kg，18～20 h后注射匹罗卡品30 mg/kg，注射匹罗卡品前30 min注射阿托品1 mg/kg，根据Racine分级，将发作≥Ⅳ级且持续时间≥30 min的大鼠判定为造模成功，注射匹罗卡品后30 min发作

1.4 实验样本的采集与处理

癫痫组E6 h、E1 d、E3 d、E7 d、E30 d、E56 d(对照组在相同时间点)经腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉。每组中4只大鼠麻醉后断头取脑，于冰上迅速分离海马，制备组织匀浆，提取蛋白，用于Western blot以检测SphK1和S1PR2在海马组织中的表达变化；另4只大鼠用4%多聚甲醛固定，取完整大脑组织，经30%蔗糖溶液脱水后，于海马吻合处行冠状冰冻切片(6 μm)，用于免疫荧光以检测SphK1和S1PR2在大鼠海马AST中的表达情况。

1.5 Western blot检测SphK1和S1PR2在大鼠海马中的表达变化

BCA法测定蛋白浓度，99℃水浴蛋白变性5 min，以30 μg上样量进行SDS-PAGE电泳(层积胶80 V；分离胶110 V)；湿法转膜(80 V恒压)；5%脱脂牛奶的封闭液中室温封闭1 h；一抗SphK1(1∶ 1 000)、S1PR2(1∶1 000)、β-actin(1∶10 000)4℃孵育过夜；TBS-T洗3次，HRP标记的羊抗小鼠(1∶10 000)、羊抗兔(1∶10 000)二抗室温孵育1 h，TBS-T洗3次，TBS洗1次；滴加ECL发光液显影，Image J软件进行灰度值测定。

1.6 免疫荧光检测大鼠海马GFAP的表达及SphK1和S1PR2在AST中的定位表达

冰冻切片于0.1 mol/L PBS中复温10 min，含10%山羊血清和0.3% 曲拉通的封闭液室温封闭2 h；分别滴加一抗：兔GFAP(1∶1000)、鼠SphK1抗体(1∶500)+兔GFAP(1∶1 000)和鼠S1PR2抗体(1∶500)+兔GFAP(1∶1 000)，4℃孵育过夜；0.1 mol/L PBS洗3次，荧光二抗(1∶1 000)室温避光孵育1 h；0.1 mol/L PBS洗3次，用含DAPI的抗荧光衰减封片剂封片，共聚焦显微镜拍照，每只动物随机取3张切片，每张切片取3个视野。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 Western blot检测SphK1和S1PR2在大鼠海马组织中的表达变化

Western blot曝光条带如图1，与Control组比较，SphK1的表达在急性期(E3 d)、潜伏期(E7 d)和慢性期(E30 d、E56 d)均明显升高(P<0.05或P<0.01)；S1PR2在急性期(E1 d、E3 d)、潜伏期(E7 d)和慢性期(E30 d、E56 d)的表达均明显下降(P<0.05或P<0.01，表1)。

Fig.1Western blot showing the time course of SPHK1 and S1PR2 expression in the rat hippocampus after PILO treatment

A: Control; B: E6 h; C: E1 d; D: E3 d; E: E7 d; F: E30 d; G: E56 d

GroupSphK1ControlPILOS1PR2ControlPILOE6 d1.27±0.210.95±0.371.06±0.061.26±0.19E1 d1.19±0.101.01±0.101.18±0.101.22±0.56E3 d1.28±0.200.54±0.10∗∗1.11±0.081.38±0.09∗E7 d1.04±0.260.51±0.07∗1.27±0.091.66±0.11∗∗E30 d1.20±0.170.53±0.21∗1.17±0.041.52±0.18∗E56 d1.11±0.170.54±0.05∗∗1.20±0.091.60±0.22∗

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.2 免疫荧光检测大鼠海马AST活化增生情况

免疫荧光结果如图2，GFAP呈绿色荧光，与对照组相比，PILO组(E7 d)大鼠海马区AST细胞数目明显增多(P<0.05)，GFAP荧光强度明显增强(P<0.05，表2)。PILO组(E7 d)AST多处于活化状态，AST由胞体小、突起少而纤细变为胞体肥大、突起多且增粗、伸长，呈放射状(图2)。

Fig.2Astrocyte activation and proliferation in rat hippocampus(Immunofluorescence ×200 )

GroupNumber of astrocytesAOD of GFAPControl32.60±6.351.19±0.33PILO (E7d)56.60±12.84∗2.21±0.74∗

AOD: Average optical density

*P<0.05vscontrol group

2.3 免疫荧光染色检测SphK1和S1PR2在大鼠海马AST中定位表达情况

免疫荧光观察到SphK1(图3A和3B)和S1PR2(图3C和3D)呈红色荧光，GFAP为绿色荧光，DAPI标记细胞核为蓝色荧光；叠加后发现SphK1在Control组和PILO组(E7d)海马AST的细胞核中表达；S1PR2在Control组海马AST的细胞质和细胞核中表达，在PILO组(E7d)海马AST的细胞质中表达。

3 讨论

难治性癫痫患者脑内AST异常增生，释放IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子，并导致α-氨基戊二酸代谢和递质传递异常，促进癫痫的进展[8]。研究发现，SphK1/S1P信号在调控神经递质的释放以及神经元和胶质细胞的增殖和存活中起着关键作用[9,10]。有研究报道SphK1和S1PR2在部分AST中表达，与神经元兴奋性调节有关[5,10]。而SphK1和S1PR2在癫痫中的研究相对较少，具体机制尚不明确。

匹罗卡品致痫模型是一种SE模型，此模型首先激活胆碱能系统诱发癫痫发作，并激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体以维持癫痫发作[11]。本研究通过匹罗卡品成功诱导大鼠SE，表现为前肢站起伴跌倒的全身强直-痉挛大发作。根据文献报道，匹罗卡品致痫大鼠经历较短的潜伏期，在SE后平均(7.2±3.6)d由视频EEG记录到第1次癫痫自发性发作，之后进入慢性期[12]。在本实验中大鼠造模后急性期E6 h～E3 d观察到癫痫发作，而在E5 d～E7 d无行为学异常为潜伏期，从E28 d开始观察到癫痫自发性反复发作，进入慢性期。

本研究在匹罗卡品致痫大鼠模型中证实SphK1在癫痫海马组织中的表达显著增加,提示SphK1在癫痫中具有潜在的研究价值。通过研究其动态变化,发现SphK1在致痫后第3日开始升高，推断SphK1参与了癫痫最初的诱发性脑损伤，SphK1在潜伏期和慢性期的表达仍高于对照组，提示SphK1很有可能参与了癫痫的形成过程，与慢性期自发性癫痫发作有关，在此过程中神经元网络的兴奋性改变，正常脑转变为癫痫脑，导致癫痫自发性发作并伴随其整个生命过程[13]。

研究表明，盐酸小檗碱通过抑制SphK1/S1P信号减轻AST介导的多发性硬化小鼠模型的神经炎症[14]。Wu等[15]发现，SphK1遗传缺失(SphK1-/-)可能通过减少神经胶质前体细胞和AST增生减轻疾病的病程。本研究结果显示SphK1在癫痫大鼠(E7d)海马AST中表达，说明SphK1表达增加可能与癫痫后AST的异常活化增生相关。我们推测癫痫发生过程中损伤的海马区SphK1被激活，局部神经元和AST合成分泌S1P增加，作为细胞内第二信使或以自分泌及旁分泌的方式作用于S1PRs，通过多途径信号传导促进了AST异常活化增生。此外，S1P合成增加可作为胞内第二信使抑制K+外向电流，增强神经元的兴奋性[16]。毛[6]发现SphK1在匹罗卡品致痫小鼠E0 h、E0.5 h时表达下调可能激活Akt/NF-κB信号通路促进SE后海马神经元的凋亡，袁等[17]报道了S1P可能通过激活PI3K-Akt抑制心肌细胞凋亡而发挥心机保护的作用，表明SphK1/S1P信号与心肌细胞和神经元的凋亡密切相关。结合本实验结果，SphK1的表达水平增加可能促进SE后海马神经元的存活，并通过离子通道机制改变了神经元的兴奋性而促进癫痫的发生。

S1PRs偶联的G蛋白亚基有重叠和不同，在中枢神经系统(central nervous system, CNS)中调节细胞增殖、迁移、炎症、细胞骨架重排和粘连等过程。在大鼠CNS发育的早期阶段，S1PR2基因在分化神经元的胞体和轴突中表达[18]。全细胞膜片钳检测到S1PR2缺陷(S1PR2 -/-)皮层锥体神经元兴奋性异常增高，由此证实了S1PR2介导的信号传导参与神经元的兴奋性调节[19,20]。Akahoshi等[5]的研究发现S1PR2 -/-可能损害某些特定CNS的功能并导致海马损伤和致死性癫痫发作，伴随着海马胶质细胞的异常增生。本研究发现S1PR2 在致痫后E3 d开始下降，在潜伏期、慢性期的表达均低于对照组的表达水平，并证实S1PR2在癫痫大鼠(E7 d)海马AST中表达，提示S1PR2表达缺陷或减少引起下游传导通路信号改变，可能导致AST异常活化增生，由此促进癫痫的发生。

综上所述，本研究初步表明SphK1和S1PR2可能通过调控AST活化增生和影响神经元兴奋性参与癫痫的发生。进一步对SphK1和S1PR2进行抑制及过表达干预，深入研究相关信号分子的表达改变，从而为癫痫的治疗提供潜在的新靶点。