耐力运动对增龄大鼠脑皮层突触可塑性的影响及相关调控机制*

刘文锋， 刘少鹏， 傅 让， 王志源， 旷何玉， 夏 艳， 汤长发

(湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室， 长沙 410012)

突触可塑性包括突触结构可塑性如突触的形态改变和神经新生形成的突触连接等，也包括突触功能可塑性如突触传递效能的改变等。突触可塑性具有多种潜在的机制，包括调节释放的神经递质的量的突触前变化，以及突触后的变化，例如新神经递质受体的掺入[1]。神经元系统突触可塑性的动态变化过程构成了大脑功能改变和行为不断变化的基础，与神经退行性病变有着密切关系。随着康复医学与运动科学的日益交叉融合发展，运动被广泛用于激活一系列生物学过程。Rebelo-Marques等[2]报道运动应被视为一种“多效药丸” (Polypill)。Cotman等[3]报道运动可以诱导脑突触可塑性相关基因如脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 等多种基因的表达。Shin等[4]报道跑台运动促进帕金森病(Parkinson's disease, PD) C57BL/6J小鼠多巴胺能神经元的突触可塑性，增加了酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydroxylase, TH)、突触小泡蛋白/突触素 (synapsin, SYN) 和突触后致密蛋白-95 (PSD-95) 的蛋白表达。

运动有利于增强和维持脑健康的研究越来越多，从而延缓神经退行性或者疾病如PD和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)等的发生发展进程，但运动对突触可塑性的作用机制还是不清楚。Ca2+/钙调素依赖的蛋白激酶或钙调蛋白激酶 (Ca2+/calmodulin- dependent protein kinases or CaM kinases, CaMK) 是脑内最为丰富的蛋白激酶之一，是诸多信号转导通道的重要调节分子，涉及包括突触可塑性、神经递质合成、突触小泡胞吐作用和突触后信号传导作用等许多神经功能。CaMKII在整个身体的多种组织中表达，并且它占脑中总蛋白质的约1%，被发现同时存在于突触前和突触后部位。突触后去极化将Mg2+推出N-甲基D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)通道孔，使Ca2+进入细胞。突触前谷氨酸与α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5methyl-4- isoxazolepropionic acid, AMPA) 和NMDA受体结合，以使突触后细胞去极化[5]。细胞内Ca2+的升高促进CaMKII自身磷酸化。CaMKII可促进含有受体的囊泡的胞吐作用，从而增加突触中受体的存在。CaMKII也可激活RasGEFs (鸟嘌呤交换因子)，并促进无活性的Ras-GDP转化为活性Ras-GTP。下游信号级联包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK or MAP kinase)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)等[5]。Zhang等[6]研究发现CaMKIIα及相互作用的蛋白如多巴胺D2受体是多种神经衰退或者退行性疾病如PD发生的关键病理机理分子之一。本文实施10周递增负荷规律的中等强度耐力运动干预增龄性大鼠，旨在了解和解析实施耐力运动改善脑皮层增龄性老化的适应性作用与机制。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

ZH-PT-1动物电动跑台(杭州立泰科技有限公司研制)，奥林巴斯BX52型光学显微镜拍照(日本Olympus公司)，组织切片机(820型号, 美国AO公司)，Image-Pro Plus Version6.0 (美国 MEDIA CYBERNETICS 公司研发)，水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)，Super Sensitive TM IHC Detection System Kit试剂盒(NO.BS13278，美国Bioworld Technology有限公司)，anti-SOD(NO.ab13533，美国abcam公司)，anti-BDNF(NO.BS6533，美国Bioworld Technology有限公司)，Goat anti-Rabbit IgG (H&L)-HRP二抗(NO.BS13278，美国Bioworld Technology有限公司), mRNAs引物(美国Gene Copoeia公司)。

1.2 实验动物及分组

将三个不同年龄健康SPF (specific pathogen free, SPF)级雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠分组：即3月龄 (青年大鼠，体重(481.25± 22.17)g，n=20)、13月龄 (中年大鼠, 体重(547.75±21.94)g,n=24)和23月龄 (老年大鼠, 体重(693.21± 68.85)g,n=24)组，动物许可证号：SCXK(湘)2009-0012，每个年龄随机分为静息组和运动组。其中青年静息组 (young sedentary group, Y-SED,n=10)、中年静息组 (middle-aged sedentary group, M-SED,n=12)和老年静息组 (aged sedentary group, O-SED,n=12)，同时相应的有青年运动组 (young aerobic exercise runner group, Y-EX,n=10)、中年运动组 (middle-aged aerobic exercise runner group, M-EX,n=12)、和老年运动组 (aged aerobic exercise runner group, O-EX,n=12)。

将所有大鼠饲养在恒温动物房中，圈养在可自由获取食物和白开水的笼子中，以国家标准啮齿类动物饲料饲养(等级为A级)，并进行12 h光照和12 h黑夜的循环。动物房保持20℃～25℃的恒定温度，相对湿度为45%～55%。实验过程中对动物的处置符合实验动物管理条例等规定。

1.3 耐力运动方案

1.4 实验取材与样本制备

运动方案结束后，所有大鼠被腹腔注射10%水合氯醛溶液(按0.5 ml/100 g体重)麻醉大鼠，将大鼠呈仰卧位于手术台上，暴露胸腔。采用升主动脉灌注：首先4℃生理盐水快速灌注60 ml，然后继续自然点滴灌注以移除血液，灌注标准为肝脏均匀被洗白。参考大鼠脑立体定位图谱(http://atlas.brain-map.org)，取大鼠脑皮层，经液氮速冻后置于-80度冰箱保存，用于荧光实时定量PCR等测试。

同时，每组进行石蜡切片样本制作：上述升主动脉灌注完生理盐水后，再用4℃4%多聚甲醛(4% PFA)-0.1 mmol/L磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4) 灌注400 ml～500 ml，直到动物的肝脏发硬和尾巴僵直才完成多聚甲醛的灌注。取脑组织保存在4℃ 4% PFA-0.1 mmol/L PBS溶液中固定48 h，转移至0.1 mol/L PBS-0.02%叠化氮溶液中，然后常规脱水、透明、进蜡和石蜡包埋。组织切片从右半脑前缘1.0 mm开始呈冠状面-矢状轴切片，依次用于苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色，超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)和BDNF免疫组织化学染色等，主要观察运动皮层M1区。

1.5 苏木精-伊红HE染色

将大脑石蜡块呈冠状面-矢状轴切成5 μm厚的组织切片，经过常规二甲苯脱腊，梯度酒精水化、苏木素染色、1%的盐酸酒精分色、5%的伊红染色、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封片，采用奥林巴斯BX52型光学显微镜拍照。

1.6 SOD和BDNF免疫组织化学的测定

采用Super Sensitive TM IHC Detection System Kit试剂盒对脑皮层组织中SOD和BDNF进行定位、定性和定量的研究。具体步骤：常规石蜡切片脱蜡水化；辣根过氧化物酶阻断剂，室温下孵育20 min，阻断内源性过氧化物酶活性；电磁炉进行抗原热修复；正常动物非免疫血清温孵育10 min，减少或消除非特异性染色；anti-SOD(NO.ab13533)和anti-BDNF(NO.BS6533)，置4℃冰箱过夜；室温孵育15 min，Goat anti-Rabbit IgG (H&L)-HRP二抗(NO.BS13278)；HRP标记链霉菌抗生物素蛋白C，室温避光孵育10 min; 苏木素染色液常规染色3 min，1%盐酸酒精(70%乙醇99 ml+30%～36%盐酸1 ml配制)分色数秒，在自来水流水中放置15 min反蓝； 经梯度乙醇脱水和二甲苯透明后，中性树胶封片。阴性对照：用PBS代替第一抗体作为空白对照。

免疫组织化学的形态学计量：采用美国COMPIX Simple PCI生物显微分析图像系统拍照，每组选片10张，每张切片镜下(×200)随机取5个视野进行分析。采用Image-Pro Plus Version6.0中的AOI(Area of interest)方式，选择测量阳性物质的总面积、平均光密度(mean optical density，MOD)和测量范围总面积。阳性产物的表达采用一定面积中平均光密度值与阳性面积值的乘积做为阳性指数(positive Index，PI)，即PI=阳性强度光密度值(MOD)×阳性反应面积/测量面积。

1.7 SYN1，AMPK/sirT，CaMK IIα和IP3R/Akt/mTOR调控基因mRNA qRT-PCR检测

本实验采用荧光实时定量PCR (qRT-PCR)检测突触素I (SYN1)、以及AMP 激活的蛋白质激酶/去乙酰化酶2 (AMP-activated protein kinase / sirtuin 2，AMPK / sirT2)、CaMK IIα和IP3R / Akt / 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)调控基因表达水平，引物见表1。

Tab.1Real-time fluorescence quantitative PCR primers for target mRNAs

从qRT-PCR测定目的基因 mRNA扩增曲线和溶解曲线可以看出，其扩增效率高，Tm值性质均一、特异性强，没有非特异性扩增，也没有形成二聚体。每组随机3个样本，每个样品3个复管进行实时荧光定量PCR，确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，记录各个基因mRNA的Ct (cycle threshold)值。以β-actin作为内参，采用2-△△Ct法，对目的基因mRNA表达进行相对定量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 耐力运动对增龄大鼠脑皮层HE染色的形态学影响

从图1可以看出，Y-SED组大鼠脑皮层的细胞核排列有序、整齐和紧密，数量很大；M-SED组大鼠脑皮层的细胞核基本整齐，紧密程度尚可，与Y-SED组比较，M-SED组的细胞核紧密程度明显要疏松，排列混乱；O-SED组大鼠脑皮层的细胞核的排列有向脑皮层深处移动的趋势，细胞核紧密程度比M-SED组更加疏松，排列更加混乱；可以看出静息组很明显呈现年龄增龄性衰老变化。实施规律耐力运动后，各年龄组大鼠脑皮层的细胞核排列紧密有序，联系大脑皮层深处的细胞核排列有序。

Fig.1Microscopic images of HE staining in aging rat cortex

Y-SED： Young sedentary group; Y-EX: Young aerobic exercise runner group; M-SED: Middle-aged sedentary group; M-EX: Middle-aged aerobic exercise runner group; O-SED: Aged sedentary group; O-EX: Old-aged aerobic exercise runner group

2.2 耐力运动对增龄大鼠脑皮层SOD和BDNF蛋白表达的影响

从图2可以看出，大鼠脑皮层SOD和BDNF阳性物质的表达主要分布在细胞核，被染成棕黑色或者棕褐色，细胞浆也有表达，被染成棕色。

从图2可以阳性指数PI值得出，与Y-SED组相比，M-SED组大鼠脑皮层的SOD表达水平下降，O-SED组SOD表达水平显著性下降(P<0.01)，SOD表达呈现增龄性下降趋势；而M-SED组大鼠脑皮层的BDNF表达水平上升，O-SED组BDNF表达水平显著性上升(P<0.05)，有意思的是BDNF表达变化趋势增龄性上升。与Y-SED组相比较，Y-EX的SOD和BDNF表达水平上调，其中SOD上调具有显著性意义(P<0.05)；与 M-SED组相比较，M-EX组SOD和BDNF表达水平均上调(P<0.05)；与 O-SED组相比较，O-EX 组SOD和BDNF表达水平显著上调(P<0.01)。

Fig.2The expressions of SOD and BDNF in aged rat cortex

A: Microscopic image of SOD immunohistochemical staining; B: Microscopic image of BDNF immunohistochemical staining; C: Analysis result of SOD expression; D: Analysis result of BDNF expression

*P<0.05,**P<0.01 sedentary groupvsexercise group;##P<0.01 young groupvsaged group;△P<0.05 middle-aged groupvsaged group

2.3 耐力运动对增龄大鼠脑皮层SYN1mRNA表达的影响

从表2可以得出，大鼠脑皮层SYN1随增龄性趋势变化不大(P>0.05)，其中M-SED组的SYN1mRNA表达水平最低(P<0.05)；与Y-SED组相比较，Y-EX的SYN1mRNA表达水平显著上调(P<0.05)；与 M-SED组相比较，M-EX SYN1mRNA表达水平变化不大(P>0.05)；与 O-SED组相比较，O-EX SYN1mRNA表达水平也显著上调(P<0.05)。

2.4 耐力运动对增龄大鼠脑皮层CaMK IIα mRNA表达的影响

从表2可以得出，大鼠脑皮层CaMK IIα随增龄性趋势变化不大(P>0.05)；与Y-SED组相比较，Y-EX的CaMK IIα mRNA表达水平显著下调(P< 0.01)；与 M-SED组相比较，M-EX CaMK IIα mRNA表达水平显著上调(P<0.01)；与 O-SED组相比较，O-EX CaMK IIα mRNA表达水平也显著上调(P< 0.05)。

2.5 耐力运动对增龄大鼠脑皮层AMPKα1/Sirt2 mRNA表达的影响

从表2可以得出，大鼠脑皮层AMPKα1和SirT2 mRNA表达水平增龄性趋势类似，与Y-SED相比较，M-SED的AMPKα1和SirT2 mRNA表达水平上调显著(P<0.05)，O-SED组AMPKα1表达水平有所增加，但SirT2 mRNA表达水平略下降(P>0.05)；与Y-SED组相比较，Y-EX的AMPKα1 mRNA表达水平上调显著(P<0.01)，M-EX和O-EX的AMPKα1 mRNA表达几乎与相应年龄的静息组表达水平一样(P>0.05)；而与各年龄静息组相比较，各相应年龄的运动组SirT2 mRNA水平均上调，其中Y-EX和M-EX上升显著(P<0.05)。

2.6 耐力运动对增龄大鼠脑皮层IP3R/AKT1/mTOR mRNA表达的影响

从表2可以得出，大鼠脑皮层IP3R、AKT1和mTOR mRNA表达水平增龄性变化趋势类似，与Y-SED相比较，M-SED的IP3R和AKT1 mRNA表达水平上调显著(P<0.05)，O-SED组的IP3R、AKT1和mTOR表达水平变化不大，但与M-SED组相比，O-SED组IP3R和AKT1 mRNA表达水平显著下调(P<0.05)；与Y-SED组相比较，Y-EX的IP3R mRNA表达水平显著下调(P<0.01)，Y-EX组AKT1和mTOR的表达水平上调，其中mTOR上调具有显著性差异(P<0.01)；与M-SED相比较，M-EX组IP3R、AKT1和mTOR mRNA表达水平均上调，其中mTOR上调具有显著性差异(P<0.05)；与O-SED相比较，O-EX组IP3R、AKT1和mTOR mRNA表达水平均上调(P<0.05)。

3 讨论

突触的结构与功能可因外界刺激或环境因素的影响发生可塑性变化，包括突触受体数量的改变，神经递质数量的变化以及对这些神经递质和产生的动作电位的反应的变化，其可以产生由特定刺激模式引起的长时程增强(long-term potentiation，LTP) 和长时程抑制(long-term drepression，LTD)[8]。BDNF 具有对突触形态调节的多效性，通过突触前和突触后的作用机制调节突触数量、突触功能和突触形态[9]。本实验发现安静组大鼠脑皮层BDNF表达变化呈增龄性上升趋势，这可能是神经退行性的一种代偿性的补偿机制，具体机制还需进一步研究。但是神经退行性疾病却是与BDNF表达的下降有密切关系，董雪帆等[10]研究发现APP/PS1小鼠小脑皮质中SYN、BDNF/Trk-B蛋白含量均明显降低，突触超微结构发生明显改变，表明AD小鼠小脑突触数量及形态变化与BDNF合成及释放减少有关。

Tab. 2 mRNAs expressions measured by real-time quantitative PCR assay in aging rat n=3)

SYN1: synapsin 1; CaMK Iia: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases Iia; AMPKα1: AMP-activated protein kinase α1; SirT2: sirtuin 2; IP3R: Phosphoinositide 3-kinase; AKT1: Protein kinase B1; mTOR: mammalian target of rapamycin

*P<0.05,**P<0.01 sedentary groupvsexercise group;#P<0.05 and##P<0.01 young groupvsmiddle-aged group;▲P<0.05 young groupvsaged group

本实验结果耐力运动各组大鼠脑皮层神经细胞核排列紧密有序，联系大脑皮层深处的细胞核排列有序，显微镜下观察细胞核的数量明显增加；同时，耐力运动提高了大鼠脑皮层SOD表达、改善了抗氧化的能力，促进了突触相关因子BDNF和SYN1表达水平增加，但是本实验没有检测神经电生理学相关指标。表明本实验采用耐力运动改善了大鼠运动皮层形态学结构和突触可塑性。宋淑华等[11]研究表明6周间歇重复跑台训练明显改善了大鼠的空间学习记忆能力，与这种类型运动更有利于促进海马BDNF基因的表达有关。Jung等[12]证明跑步运动通过抑制受损脊髓中的细胞凋亡来促进运动功能的恢复，运动带来的有益作用可能归因于通过激活PI3K / Akt途径诱导神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、神经营养因子3(neurotrophin-3, NT-3)和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor 1, IGF-1)等神经营养因子的表达。Kaplan等[13]报道BDNF通过激活MEK (MAPK激酶) /ERK信号、PI3K /Akt 和磷脂酶Cγ1 (PLCγ1) 等信号通路调节下游靶分子。BDNF与其特异性酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B, TrkB) 结合后能够引起下游关键激酶的磷酸化，促进BDNF在神经元胞体和树突中的合成，进而激活相应的信号转导通路，也可能BDNF在这些部位合成后被运送到突触前神经元后再发挥其调控功能，这两种可能都可以解释为BDNF的突触前调控机制。BDNF还参与调节谷氨酸和γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid, GABA) 能突触的突触后神经递质受体的数量与分布，即突触后调控作用。

CaMKII被发现同时存在于突触前和突触后部位，参与突触可塑性、神经递质合成、突触小泡胞吐作用和突触后信号传导作用等。Lisman[14]报道突触后致密结构的重要组分CaMKII约占突触蛋白总量的30%～50%，这种高浓度的存在及其自身磷酸化，在突触部位发挥着记忆的分子开关作用。CaMKIIα在Ca2+/CaM信号系统中发挥了重要作用，不同Ca2+浓度和不同亚细胞区域的Ca2+激活不同底物CaMKⅡ或蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1, PP1)。CaMKII无疑是解释耐力运动改善突触可塑性机制的首选靶标分子。本实验进一步结果显示耐力运动显著上调了中年和老年大鼠脑皮层CaMKIIα表达水平(P<0.01)，但是对青年大鼠CaMKIIα表达水平却是下调(P<0.01)，实验表明耐力运动通过CaMKIIα重要的调节作用而改善衰老过程中脑皮层突触可塑性。但是关于耐力运动通过CaMKII改善突触可塑性的作用机制还是不清楚。Ferraro等[15]报道CAMKs可能是AMPK，p38 MAPK和组蛋白去乙酰化酶5 (histone deacetylase 5, HDAC5)的上游激酶。表明CaMKII可能通过激活AMPK进行调控。研究表明AMPK与神经退行性疾病的发生具有潜在的联系[16]，AMPK的磷酸化由AMP / ATP比率或某些激酶，例如肝激酶B1 (liver kinase B1, LKB1)和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β (CaMKKβ)的表达水平升高而被激活。本实验结果表明耐力运动上调青年大鼠脑皮层的AMPKα1表达水平(P<0.05)，而对中年和老年大鼠AMPKα1的作用不显著，但耐力运动均上调了SirT2表达水平。研究报道SirT1和SirT2激活AMPK，它们是p53的直接靶标，AMPK的活化抑制mTOR活性[17]。Sirtuins (SirT)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的III类组蛋白脱乙酰酶，在细胞核和细胞质中起作用，并参与多种生物过程，如氧化代谢、炎症、DNA转录、胰岛素分泌、细胞衰老、细胞凋亡和DNA修复等。Hawley 等[18]研究显示CaMK的下游激酶CaMKK-α和CaMKK-β均能激活AMPK的活性及其磷酸化，CaMKK-β比CaMKK-α更快地激活AMPK。这提示CaMK与AMPK之间存在上下游作用关系，但从本实验结果来看，CaMKII可能还通过其他途径调控。

AMPK和mTOR之间的相互关系，有学者报道诸如SirT1、p53和IGF-1等分子可以把调控自噬与Ca2+信号传导和氧化应激等串联起来。SirT1通过使ATG5和ATG7脱乙酰作用来上调自噬，有助于LC3 II转化，并激活AMPK、抑制mTOR的。Sirtuins还能激活p53增加sestrin (Sesn)表达水平，参与过氧化物还原酶(peroxiredoxin)循环，降低活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。相反，IGF-1途径具有促衰老活性，增强ROS产生并降低GPx。IGF-1 / IGFR结合通过胰岛素受体底物1 (insulin receptor substrate-1, IRS-1)增加PI3K活性，提高IP3水平(从内质网释放Ca2+)和激活AKT，导致mTOR活化(通过抑制TSC2和Ras家族Rheb)和抑制自噬[19]。本实验结果表明，整体上耐力运动起到了上调各年龄大鼠脑皮层的IP3R/AKT1/ mTOR的表达水平。Vaynman S等[9]实验发现运动通过BDNF调节 cAMP-反应元件结合蛋白(cAMP-response- element binding，CREB)和SYN1表达水平，CREB和SYN1具有调节基因转录和影响突触传递来修饰神经元的功能。BDNF能够同时增加其自身及其TrkB受体的mRNA水平，表明运动可以使用反馈环来增强BDNF对突触可塑性的影响，具体机制表现为BDNF通过NMDA、CaMKII和MAPK等分子介导运动诱导突触可塑性。张媛等[20]发现抗阻训练可通过激活PI3R / Akt / TSC2 / mTOR信号通路，而耐力运动则通过激活AMPK信号通路、抑制mTOR的活性。总之，本实验表明耐力运动可能通过CaMKIIα信号通路协同AMPK信号通路和启动IP3R / AKT1 / mTOR信号通路而发挥重要调控作用，具体机制值得进一步研究。

综上，耐力运动通过上调BDNF的表达水平，调控CaMKIIα信号、激活AMPK信号通路和IP3R/AKT1/mTOR信号通路，改善脑皮层的突触可塑性。