Sestrin2对热暴露肺上皮细胞凋亡的干预作用及其机制*

杲修杰， 王 尚， 刘伟丽， 王 坤， 陈照立， 王新兴

(军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所， 天津 300050)

当机体处于热环境中时，会引起产热增加、出汗增多、心血管系统紧张性增加、消化液分泌减弱、中枢神经系统兴奋性降低等应激反应。热暴露温度过高或持续时间过长可引起细胞凋亡，而线粒体在促凋亡信号和Caspases激活之间起着不可替代的作用，线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)降低是细胞凋亡的早期信号。活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧簇。中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死，也可双向调控某些肿瘤细胞的凋亡和增殖[1]。Sestrin2蛋白是一种重要的抗氧化应激的蛋白，在细胞的生长、凋亡、自噬等过程中起着重要作用[2-4]。本实验通过调控Beas-2B细胞中Sestrin2蛋白的表达水平，探讨Sestrin2在热暴露引起的细胞凋亡过程中的保护作用，为深入研究热暴露致细胞凋亡的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

Beas-2B细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(北京雷根生物技术公司)，活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术公司)，Caspase-9活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术公司)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术公司)，Sestrin2和SOD一抗(美国Sigma公司)。

1.2 热暴露细胞模型的建立

Beas-2B细胞培养使用含FBS10%的DMEM培养基培养，培养箱中CO2浓度为5%，温度为37℃，使用胰酶消化液消化并传代培养，细胞接种于六孔板中，密度为105cells/well。接种12 h后开始实验。不同温度热暴露实验模型中，对照组细胞不做任何处理，热暴露组细胞水浴锅中水浴升温至39℃、40℃、41℃。不同时间热暴露实验中，对照组不做任何处理，热暴露组于41℃分别处理3 h、6 h或12 h。

1.3 基因转染

转染用的Sestrin2高表达核酸序列来源于GeneBank(NM_031459.4)，将其克隆入高表达质粒pcDNA3.1+中。转染采用Invitrogen公司的Lipfectamine 2000试剂。

1.4 Western blot检测Sestrin2、超氧化物歧化酶(SOD)的表达

分别取不同温度热暴露组或暴露不同时间的细胞(约106cells/well)，用胰酶消化收集细胞后，加入RIPA裂解液冰上处理后，12 000 r/min离心15 min，收集上清，-80℃保存备用。采用BCA法检测蛋白总量后，取适量进行SDS-PAGE电泳，然后进行转膜，脱脂奶粉封闭1 h后，孵育相应的一、二抗体进行WB检测，观察Sestrin2和SOD在细胞内的表达。

1.5 细胞线粒体膜电位检测

采用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential， MMP)，使用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒，细胞按照试剂盒说明书进行处理后上机检测。

1.6 ROS活性检测

细胞中的活性氧检测采用上海碧云天生物技术公司出产的活性氧检测试剂盒。各组细胞去除培养液后，加入稀释后的DCFH-DA，37℃培养20 min，用培养液洗涤3次后收集细胞，使用荧光分光光度计检测。

1.7 Caspase-9活性和细胞凋亡率检测

采用上海碧云天生物技术公司生产的Caspase-9活性检测试剂盒检测细胞中Caspase-9活性。各组细胞收集后用PBS缓冲液洗3次后，裂解，12 000 r/min离心15 min后取上清用BCA法定量蛋白浓度，然后按照试剂盒说明书进行活性检测。细胞凋亡检测采用上海碧云天生物技术公司生产的Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测。细胞消化后按照产品说明书进行细胞的处理并上机检测。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 热暴露对Sestrin2、线粒体功能和细胞凋亡的影响

随着热暴露温度的升高，与37℃组比较，热暴露Beas-2B细胞中Sestrin2蛋白表达水平逐渐降低，41℃组显著降低(P<0.05)。在41℃暴露条件下，随着暴露时间的延长，Beas-2B细胞中Sestrin2蛋白表达水平也逐渐降低，12 h组显著降低(P<0.05)(图1)，细胞的线粒体膜电位MMP逐渐下降(P<0.05)；41℃热暴露组，随着时间的延长，细胞Caspase-9活性显著增强(P<0.05)，细胞凋亡率增加(表1)。

Fig.1Expressions of Sestrin2 in Beas-2B cells exposed to different temperatures for multiple time points (n=3)

Time (Thermal exposure 41℃)MMP (590 nm/530 nm)Activity of Caspsse-9(% 0 h)ApoptosisRatio (%)0 h2.20±0.19 100±193.6±0.33 h1.60±0.13∗ 260±20∗6.0±0.6∗6 h0.86±0.22∗ 420±41∗14.0±1.0∗12 h0.60±0.11∗ 676±62∗22.0±2.3∗

*P<0.05vscontrol group

2.2 Sestrin2对线粒体膜电位和细胞凋亡的调控作用

在Beas-2B细胞中转染高表达Sestrin2载体，Sestrin2蛋白表达升高，说明成功构建高表达Sestrin2载体Beas-2B细胞。在41℃暴露条件下，高表达Sestrin2组细胞与对照组相比，随暴露时间延长引起细胞MMP的下降趋势得到明显缓解(P<0.05)，同时细胞凋亡率降低(P<0.05，图2)。

Fig.2Effects of Sestrin2 on cell mitochondrial membrane potential and apoptosis(n=3)

A： Expression of Sestrin2 in Beas-2B cells after high-expression plasmid transfected； B： MMP of Beas-2B cells exposed for different times； C： Apoptosis ratio in Beas-2B cells exposed for different times

*P<0.05vs0 h

2.3 ROS在热暴露Beas-2B细胞凋亡过程中的作用

ROS检测结果表明，在41℃暴露条件下，随着暴露时间的延长，细胞中的ROS水平显著升高(P<0.05，图3)，而Sestrin2蛋白高表达组与空载体组比较，ROS水平的显著降低(P<0.05)。细胞高表达SOD，可显著降低热暴露导致细胞MMP水平下降的趋势(P<0.05)，并能够有效抑制热暴露引起的细胞凋亡(P<0.05)。

3 讨论

Sestrin2是sestrins蛋白家族中的重要成员，进化上高度保守，其编码基因位于6号染色体q臂21位点。研究表明，Sestrin2与细胞的增殖和活力密切相关，具有重要的抗氧化应激作用[5]。当细胞处于应激条件时，Sestrin2表达水平升高，进而激活相应的转录因子，如P53、FoxO、CCAAT、ATF4、AP-1等，通过基因转录、蛋白翻译等过程调控细胞的生长、凋亡和自噬等。有研究报道，Sestrin2可缓解肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、心血管疾病等所引起的氧化应激损伤[6-8]。本研究细胞学实验表明，Beas-2B细胞中Sestrin2蛋白表达水平，随着暴露温度的升高逐渐降低，在41℃条件下，随着暴露时间的延长Sestrin2蛋白水平降低，12 h暴露可引起细胞中Sestrin2蛋白水平的显著下降 (图1A，1B)。

Fig.3Role of ROS in Sestrin2 protecting against heat exposure in Beas-2B cells(n=3)

A: The ROS level of Beas-2B cells exposed for different times; B: The ROS level in Beas-2B cells after Sestrin2 high-expression plasmid transfected; C: Expression of SOD in Beas-2B cells exposed to different temperatures; D: The expression of SOD after SOD high-expression plasmid transfected; E: The ROS level after SOD high-expression plasmid transfected; F: MMP of Beas-2B cells after the high-expression of SOD; G: The apoptosis ratio after Sestrin2 high-expressed

*P<0.05vs0 h

细胞凋亡是为维持内环境稳定，由基因控制细胞自主的程序性死亡。线粒体是各种死亡刺激的感受器和凋亡过程的重要场所。细胞受到外部刺激因素如DNA损伤、射线、激素等刺激后，线粒体外膜通透性增大，线粒体膜去极化，跨膜电位下降，线粒体膜转运孔道开放，线粒体间隙中的细胞色素C释放至胞质中，逐步激活下游caspase酶的级联反应，最终引起细胞的凋亡[9]。本研究建立的热暴露细胞模型中，41℃热暴露12 h组，细胞线粒体膜电位MMP显著降低，细胞Caspase-9活性显著增强，进而引起细胞凋亡率显著增加(图1 C-E)。高表达Sestrin2蛋白可有效缓解高温暴露引起的细胞MMP降低和细胞凋亡率的升高(图2)，这些研究结果表明，Sestrin2蛋白在热暴露引起的细胞凋亡过程中发挥重要作用。

氧化应激是由细胞内氧化反应和抗氧化反应不平衡引起的，过量的ROS可激发体内的抗氧化防御系统，造成体内内环境异常，进而引起细胞内多种氧化应激反应，造成蛋白质结构突变或生物活性丧失、DNA受损、位点突变，以及原癌基因与肿瘤抑制基因突变，最终导致机体产生氧化损伤[10-12]。有研究表明，Sestrin2可作为p53的转录调控底物分子在氧化应激反应中被活化，进而发挥保护细胞生存和维持细胞繁殖等作用[13]。本研究结果表明，Beas-2B细胞在41℃热暴露条件下，随着暴露时间的延长，细胞中的Sestrin2蛋白表达水平下降，细胞中的ROS水平显著升高。通过转染高表达载体提高Sestrin2蛋白和SOD表达水平，可有效缓解高温暴露引起的ROS水平升高，从而减轻了热暴露引起细胞膜电位的降低和细胞凋亡率的升高(图3)。因此，我们有理由推测，热暴露引起细胞中Sestrin2蛋白表达水平下降，进而引起细胞中SOD水平降低，这二者水平的下降导致细胞中ROS水平升高，加剧了细胞的氧化应激损伤，最终导致细胞凋亡率的升高。

综上，Sestrin2蛋白在热暴露细胞模型中发挥着重要的靶点作用。细胞在受到外部热应激刺激时，Sestrin2蛋白水平表达下降，进而引起细胞中SOD水平的下降，细胞中ROS水平升高，从而加剧了细胞的氧化应激损伤，最终加剧细胞凋亡的进程(图4)。Sestrin2蛋白可能通过这一途径调节细胞在热环境暴露下的凋亡过程，对肺上皮细胞具有保护作用，本研究为探讨热暴露条件下细胞凋亡发生机理提供了重要的实验依据。

Fig.4Schematic diagram of mechanism of Sestrin2 in the process of apoptosis induced by heat exposure