慢性荨麻疹患者FCER1A遗传多态性对咪唑斯汀临床疗效的影响

左艳芝，刘 丹，李新刚

(1.山东省单县东大医院皮肤科，山东菏泽 274300;2.山东省成武县中医院皮肤科，山东菏泽 274200；3.首都医科大学附属北京友谊医院西药剂科，北京 100050)

荨麻疹是因皮肤、黏膜小血管扩张及渗透性增加而导致的一种局限性水肿反应，常先有皮肤瘙痒，随即出现鲜红色、苍白色或皮肤色风团，少数患者有水肿性红斑。风团的大小和形态不一，发作时间不定，逐渐蔓延，融合成片。荨麻疹的病因复杂，大部分患者查不出明确原因，迁延难愈的荨麻疹对患者的生活和工作造成了很多困扰。抗组胺类药物是临床治疗荨麻疹的一线药物，具有较强的抗组胺和抗其他炎症介质的作用[1]。常用的H1受体拮抗剂有咪唑斯汀、氯雷他定、西替利嗪等。临床发现有少部分患者即使规律服用咪唑斯汀，对荨麻疹的治疗效果仍然不佳。有研究报道FCER1A基因的遗传多态性与咪唑斯汀治疗荨麻疹的临床效果相关[2]。本研究收集了患者的血液样本，检测FCER1A基因的常见变异位点，旨在探索慢性荨麻疹患者FCER1A基因多态性对咪唑斯汀临床疗效的影响。

1 资料和方法

1.1 研究对象 选取2015年1月至2017年12月就诊于山东省单县东大医院的慢性荨麻疹患者，所有患者均满足《荨麻疹诊疗指南(2007版)》[3]的诊断标准：临床特征表现为有大小不等的风团伴瘙痒，同时伴有或单独表现为血管性水肿。慢性荨麻疹是指停止治疗后风团伴瘙痒每周至少发作两次，持续时间≥6周；少数慢性荨麻疹患者也可表现为间歇性发作。所有入组患者均为汉族人群，记录其性别、年龄(>18岁)、合并用药情况、发病时长等相关信息。患者入组前2周内未接受抗组胺、激素、抗抑郁等相关药物治疗，对抗组胺药物无过敏反应和不良反应。排除标准：(1)除荨麻疹外并发其他皮肤疾病；(2)患有自身免疫性疾病、甲状腺疾病、感染疾病或精神病；(3)正在接受非甾体抗炎药、免疫抑制剂或糖皮质激素治疗；(4)患有遗传性荨麻疹、血管炎；(5)孕妇或哺乳期妇女[2]。

1.2 样本采集与DNA提取 由于饮食与采血时间不影响患者的基因型测定，因此只要患者同意进入本研究，立即采集2～3 ml患者外周血置紫帽抗凝采血管中(抗凝剂为乙二胺四乙酸)，采用酚-氯仿法提取DNA[4]，-20 ℃保存备用。

1.3 检测位点的筛选与基因检测 基于HapMap数据库，筛选最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)>0.05的突变位点，并对这些位点的连锁不平衡情况进行分析。基于连锁不平衡分析筛选标签单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，并对所有位点进行功能预测。基于功能预测筛选功能SNP，将标签SNP与功能SNP合并，确定最终要检测的SNP位点[5]。采用MassARRAY单核苷酸多态性质谱基因分型法，设计上述SNP位点的延伸引物，利用MALDI-TOF质谱技术测定各个SNP位点的单核苷酸延伸反应，检测各个位点的突变基因型。该部分工作由专业基因测序公司采用Sequenom平台完成。实验流程包括：引物设计与合成、引物稀释、PCR反应、纯化反应、单碱基延伸反应、树脂纯化、上机检测、收集数据[6]。

1.4 荨麻疹活动性评分 对入组患者进行荨麻疹活动性评分(urticaria activity score，UAS)，包括计算风团数量和瘙痒程度。风团数量计分为0～3分。0分：<10个小风团(直径<3 cm)；1分：10～50个小风团或<10个大风团(直径>3 cm)；2分：>50个小风团或10～50个大风团；3分：几乎全身躯体受累。瘙痒严重程度评分0～3分。0分：无瘙痒；1分：轻度瘙痒；2分：中度瘙痒；3分：重度瘙痒。记录患者治疗前(UAS0)和接受咪唑斯汀单药治疗7 d后的UAS(UAS7)。单药治疗7 d后，UAS下降程度≥50%的患者作为治疗有效，<50%者作为治疗无效，基于上述标准将患者分为有效组和无效组[7]。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。连续变量采用t检验，分类变量和哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weiberg equilibrium，HWE)采用χ2分析，用在线工具(https://snpinfo.niehs.nih.gov/Haploview)进行连锁不平衡分析并挑选标签SNP位点，用Plink软件以χ2分析和逻辑回归分析各位点对药物疗效的影响[8]，以P<0.05作为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 入组患者基线信息 共收集符合入组标准的慢性荨麻疹患者128例，其中有效组103例，无效组25例，两组患者的基线信息如表1所示。两组患者在年龄、性别、疾病时长、UAS0等方面无统计学差异。由于本研究是根据UAS下降值进行分组，故UAS7在两组间差异明显。

2.2 检测位点的筛选结果 对MAF>0.05的突变位点的连锁不平衡情况进行分析，结果见图1。基于连锁不平衡分析筛选得到的标签SNP见表2，对所有位点的功能预测结果见表3。表3中转录因子结合位点即基因启动表达时与转录因子结合的区域，剪接位点即转录为mRNA时要剪接的位点，剪接位点变异可导致蛋白质功能的增强或减弱。非同义突变可引起密码子改变，导致氨基酸变化；终止密码子突变会引起转录序列延长。通过数据库预测各位点是否具有致病性，结果显示rs2247584，rs2298804和rs2298805经预测均具有一定的功能。最终选择的检测位点为rs2427828、rs7548864、rs2247584、rs2269718、rs2298805、rs11809585、rs2298804。

表1 两组患者的临床基线特征Table 1 Clinical characteristics of the patients in the two groups at baseline

**P<0.01，与有效组比较

图1 筛选位点的连锁不平衡分析结果图Figure 1 Linkage disequilibrium analysis plot of the selected SNPs

表2 基于连锁不平衡分析筛选的标签SNPTable 2 The selected Tag SNP based on the results of linkage disequilibrium analysis

2.3 相关性分析 采用Plink软件对变异位点的MAF和HWE进行检验[9]，各位点对咪唑斯汀临床疗效的影响采用χ2检验和逻辑回归，结果见表4。本研究中，所有位点的MAF均>0.05，所有位点在患者中均符合HWE，表明人群选择无偏倚，χ2检验和逻辑回归的结果一致，位点rs2298805 (G→A)的变异对咪唑斯汀治疗荨麻疹的疗效具有显著影响(P<0.05)，A位点携带者接受咪唑斯汀的治疗效果较好。

表3 SNP检测位点的功能预测结果Table 3 SNP function prediction results

SNP：单核苷酸多态性；Y：是；N：否

表4 SNP检测与统计分析结果Table 4 The results of SNPs detection and statistical analysis

3 讨 论

本研究以FCER1A基因为观测指标，较完整地检测了FCER1A基因的高频率突变位点，并对标签SNP位点、功能SNP位点与咪唑斯汀的临床疗效进行了相关性分析。发现rs2298805 (G→A)的变异对咪唑斯汀治疗荨麻疹的疗效具有显著性影响(P<0.05)，即A位点携带者对咪唑斯汀治疗荨麻疹的效果较好。

IgE与高亲和力受体(FcεRI)的结合是过敏性疾病发生、发展中的首要环节。FcεRI由α、β和γ 3种不同的亚基组成，其中受体与IgE的结合点位于其α链的胞外区近膜端，IgE与FcεRI的结合触发活化信号转导至β和γ链。对于过敏反应的发生，α链不可或缺，并且为FcεRI所特有。IgE与FcεRI在过敏反应效应细胞表面的结合具有影响FcεRI表达的数量，以及通过延长IgE半衰期，调节血清中总IgE水平的双向效应。在这一双向效应中，FcεRIα亚基最为关键。FCER1A基因是由6个外显子组成的蛋白质编码基因，位于人类染色体1q23，其编辑的蛋白质即为FcεRIα亚基。近年来，编码α亚基的FCER1A基因与过敏性疾病的相关性引起了研究者的关注[10]。研究发现，FCER1A基因多态性与IgE血清水平相关[2]，限于研究经费和实验条件，本研究未检测患者的IgE水平，这也是本研究的不足之处。

从功能预测结果来看，rs2298805处于该基因的剪接位置，可能是外显子剪接增强子(exonic splicing enhancer，ESE)或抑制子(exonic splicing silencer，ESS)。此外，该位点亦为错义突变，密码子由AGT突变为AAT，导致了氨基酸的改变(Ser→Asn),致病性预测结果为可能有害。本研究从临床层面证实了该位点变异对药物临床疗效的影响显著，若想要从机制层面研究该位点的功能，需要进一步设计基础的功能实验加以证实。药物基因组指导下的个体化用药是当前的研究热点[11]。本研究以发现FCER1A基因的rs2298805位点变异对咪唑斯汀治疗慢性荨麻疹的效果具有显著影响，通过对该基因的检测有助于临床预判药物的临床疗效，使患者受益。