慢性自发性荨麻疹患者血清差异表达蛋白的筛选及C反应蛋白的测定

徐顺明， 曹艳云， 孔 伟， 徐 徉， 蔡海斌

上海市浦东新区人民医院皮肤科,上海 201299

慢性自发性荨麻疹(chronic spontaneous urticaria, CSU)是指风团与血管性水肿自发性表现超过6周的慢性荨麻疹[1]。CSU是一种炎症性疾病，可由免疫、遗传和环境因素(包括感染)的相互作用引起[2]，患者血清中存在多种炎症标志物的异常改变。CSU患者血清中C反应蛋白(C-reaction protein, CRP)也存在一定变化，但临床意义尚不明确。

因此，本研究采用同位素标记相对与绝对定量(isobaric tag for relative absolute quantitation，iTRAQ)技术对风团持续时间不同的CSU患者血清进行差异蛋白鉴定，探讨CSU患者血清CRP水平与风团持续时间的相关性。

1 资料与方法

1.1 入选及排除标准 2015年7月至2016年8月我院收治的CSU患者纳入研究范围。入选标准：年龄18～65岁，风团单个皮损持续时间小于24 h，风团反复发作病程超过6周，且每天或几乎每天发作，符合慢性自发性荨麻疹诊断标准；患者就诊时观察到有风团存在。排除标准：有过敏性鼻炎、哮喘、特应性皮炎等过敏性疾病史和寄生虫感染史；妊娠及哺乳期妇女；伴血管性水肿、可诱导性荨麻疹；严重的系统性疾病、吸毒和酗酒者；就诊前3 d内使用过抗组胺药物，1个月内使用过皮质类固醇激素、免疫抑制剂、止血或抗凝血药。本研究通过我院医学伦理委员会审核批准，所有患者及健康对照均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 伯乐公司Protein Miner去除高丰蛋白的试剂盒，iTRAQ同位素定量试剂盒；高pH反相色谱分离：柱子信息为2.1×150 mm X Bridge BEH300(Waters公司，加拿大)；色谱仪器为Waters公司UPLC高效液相色谱；第二维反相液质联用RPLC-MS：数据采集软件为Analyst TF (Sciex公司，加拿大)；反相柱信息：ZORBAX 300SB-C18 column(5 μm, 300Å, 0.1×150 mm，Microm，美国)；Eksigent 1D plus色谱仪，Triple TOF 5600质谱仪(Sciex公司，加拿大)。免疫散射比浊法检测仪为普门科技PA-990。

1.3 血清差异蛋白的鉴定

1.3.1 研究对象及分组 20例CSU患者病程2个月～48个月，根据风团持续时间分为2组：风团持续时间<2 h组(n=10)，其中男性3例，女性7例，年龄20～48岁；风团持续时间12～24 h组(n=10)，其中男性7例，女性3例，年龄26～61岁。另选10例来自本院的健康体检者作为健康对照组，男性5例，女性5例，年龄22～54岁。

1.3.2 标本采集及测定 标本采集：2组CSU患者和健康对照者各抽血5 mL，静置后4 000 r/min(r=10 cm)，离心5 min，留取上清，分组按序编号，-80℃保存待测；血清处理：血清标本同批次检测，采用ProteoMiner Large-Capacity试剂盒去除高丰度蛋白，洗脱下来的样品通过Bradford法进行定量；利用胰酶对各组蛋白质分别进行酶解；利用iTRAQ试剂盒对各组蛋白进行定量标记，把标记完的样品混合；混合后的蛋白进行2次二维液相色谱质谱分析；利用Mascot软件分析质谱数据，采用Paragon算法来执行数据库搜索。蛋白质检索数据库为HumanSwissProt。进一步筛选差异蛋白进行后续分析。所有实验包含2次技术重复。

1.4 CRP水平的检测 在差异蛋白鉴定后，选取63例CSU患者，根据风团持续时间分为2组：每天风团持续时间<2 h者29例，发病以来每天风团发作持续时间12～24 h者34例。另选健康体检者作为健康对照组33例。免疫散射比浊法检测方法：3组血清标本采集如前，血清标本同批次检测，按试剂盒说明书进行检测。

2 结 果

2.1 各组间差异蛋白表达情况 结果表明：3组间存在不同数量的蛋白表达差异。与健康对照组相比，风团持续时间12～24 h组患者的差异表达蛋白有20个，其中上调5个，下调15个；风团持续时间小于2 h组患者的差异蛋白共有31个，上调12个，下调19个。风团持续时间12～24 h组/健康对照组间及风团持续时间<2 h组/健康对照组间共同的差异蛋白有14个，包括上调蛋白5个和下调蛋白9个。与风团持续时间<2 h组相比，风团持续时间12～24 h组的差异蛋白18个，其中上调4个，即CRP、serum amyloid P-component (SAP)、monocyte differentiation antigen CD14和putative protein FAM10A5；下调14个，包括tropomyosin alpha-4 chain (TM30p1)、keratin-14、Ig gamma-4 chain C region、immunoglobulin kappa variable 1D-33、hemopexin、pleckstrin、cofilin-1、complement factor H-related protein 2、cytokeratin-2e (CK-2e)、cytokeratin-9(CK-9)、actin、cytokeratin-1(CK-1)。3组间CRP均为上调蛋白，但CRP在风团持续时间12～24 h组的比值最高；而风团持续时间12～24 h组和健康对照组患者CRP比值相近。

2.2 CSU患者与健康对照组血清CRP水平的比较 结果表明：风团持续时间<2 h组、风团持续时间12～24 h组、健康对照组CRP水平分别为(0.865±2.120)、(3.727±8.416)、(0.447±0.674)mg/L，组间差异有统计学意义(F=3.9705，P<0.05)。风团持续时间<2 h组患者CRP水平与风团持续时间12～24 h组、健康对照组间均无明显差异，而后两组间差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

CSU危害生命的风险低，但对患者生活质量的影响很大[3]。临床上，由于病因和发病机制不同，风团持续时间各不相同，部分患者风团持续时间<2 h可自行消退，另有部分患者风团持续12～24 h方可消退，伴有明显瘙痒，给患者带来了痛苦。目前尚无有效的方法判断患者风团的持续时间，对于风团发生后的持续时间，也无明确的划分标准，有分为2 h内和超过2 h者，以及<24 h和超过24 h者[4]。本研究分为风团持续时间<2 h及风团持续时间12～24 h进行对比研究。

蛋白质组学技术在CSU研究领域应用较少。本研究采用iTRAQ技术对风团持续时间不同的CSU患者和健康对照者之间血清进行蛋白表达研究，结果表明3组间存在差异表达蛋白。进一步比较组间差异蛋白，结果发现14种蛋白为共同差异蛋白。这些蛋白是否与风团发作及风团发作持续时间有关尚不清楚。目前已经确认了CSU具有多种潜在的标志物[5]。风团的形成，尤其是持续时间长、不易消退的风团形成机制十分复杂，参与风团形成的血生物标志物更多[6]。本研究鉴定的共同差异蛋白在风团形成与消退的过程中有无作用及如何发挥作用有待进一步的研究探讨。

CRP是经典补体级联反应的强活化剂，可在某些条件下开始或加剧炎性病变[7]。CSU患者血清CRP是否增高一直存有争议[8-12]。本研究结果表明，与健康对照相比，CSU患者血清中的CRP均为上调蛋白，说明CRP表达与CSU风团发作有关。CRP在风团持续时间12～24 h组患者中表达最明显，提示CRP表达与风团持续时间有关，风团持续时间长，血清CRP表达上调明显，风团持续时间短，血清CRP虽有上调表达，但不明显。经免疫散射比浊法进一步检测，风团持续时间长的CSU患者血清CRP水平高于健康对照，差异有统计学意义，而风团持续时间短的CSU患者血清CRP水平与健康对照组间无差异。这一结果提示，风团持续时间长的CSU患者血清CRP可作为炎症性标志物，而在风团持续时间短的CSU可能不具有炎症性标志物的价值。

综上所述，本研究通过iTRAQ技术检测风团持续时间不同的CSU患者血清的差异蛋白，试图寻找不同的风团形成过程中的蛋白质差异，为研究CSU的发病机制和诊疗手段提供线索。研究结果提示，CSU患者血清CRP表达与风团持续时间有关，风团持续时间较长的CSU患者血清CRP水平高于健康对照。血清CRP在风团持续时间长的CSU患者中具有炎症性标志物的意义。

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