慢性自发性荨麻疹患者外周血嗜碱粒细胞CD63和CD203c的表达

孔 伟 曹艳云 曹秀妮 徐 徉 蔡海斌 徐顺明

慢性自发性荨麻疹(chronic spontaneous urticarial, CSU)是指不论病因是否清楚，不依赖于任何外源性物理刺激，由内源性因素引起的慢性荨麻疹[1]。嗜碱粒细胞和肥大细胞与CSU的发病机制相关，虽然嗜碱粒细胞占体内白细胞的比例不到1%，但它是IgG介导的过敏反应的主要参与者之一，且能募集促炎细胞，如嗜酸粒细胞和中性粒细胞[2]。此外，嗜碱粒细胞有多种表面标志物表达，其中CD63和CD203c是判断嗜碱粒细胞活化和分化最有效的标志物[3,4]。

我们采用流式细胞术检测风团持续不同时间以及治疗后风团消退、病情暂时控制的CSU患者外周血中嗜碱粒细胞CD63和CD203c的表达水平，评估嗜碱粒细胞在风团不同状态下的活化情况，探讨外周血嗜碱粒细胞活化在CSU发病机制中的意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象 随机选择本科室2017年12月至2018年12月前来就诊的CSU患者。病例入选标准：(1)18～65岁；(2)风团单个皮损持续时间<24 h，反复发作6周以上，每周至少发作2次；(3)无过敏性鼻炎，哮喘，特异性皮炎等过敏性疾病病史；无寄生虫感染及自身免疫性疾病病史；(4)符合慢性自发性荨麻疹诊断标准。排除标准：(1)妊娠及哺乳期妇女；(2)遗传性血管性水肿、慢性可诱导性荨麻疹和其他类型慢性荨麻疹；(3)过去3天内使用过抗组胺药物，过去4周内已使用过糖皮质激素、免疫抑制剂、止血或抗凝血药；(4)合并皮炎、湿疹等引起瘙痒的皮肤病。(5)严重的系统性疾病，包括心脏病、严重肝肾功能不全、血液系统疾病、自身免疫性疾病，慢性感染、精神病、恶性肿瘤、高血压、糖尿病、吸毒和酗酒患者等。本研究通过我院医学伦理委员会审核批准，所有患者及健康对照均签署知情同意书。评分标准[1]：患者入组，填写临床调查表，了解治疗前的风团情况与风团持续时间、瘙痒症状、并进行量化评分。按下列两项进行评价：评分相加即为总评分。(1)风团数目：0分为无风团；1分为风团数<20个/24 h；2分为风团数20～50个/24 h；3分为风团数>50个/24 h，或有大面积风团。(2)瘙痒程度：0分为无瘙痒；1分为轻度瘙痒；2分为中度瘙痒，但不影响日常生活和睡眠；3分为重度瘙痒，不能忍受，严重困扰日常生活和睡眠。治疗方案选择：选用一种或两种新一代抗组胺药物依巴斯汀片(10 mg，1/日，口服)和/或左西替利嗪胶囊(5 mg，1/晚，口服)，如经治疗4周皮疹仍未控制者，纳入剔除范围。

1.1.2 分组方法 共选取符合研究要求的CSU患者45例。按风团持续时间与治疗情况纳入A、B、C三组。

A组：风团在2 h内自行消退者15例，其中男性5例，女性10例，平均年龄(38.38±11.05)岁(22～61岁)。风团未消退时采集血样。B组：风团持续12～24 h自行消退者15例，其中男性6例，女性9例，平均年龄(40.64±13.09)岁(21～61岁)。风团未消退时采集血样。C组：经治疗后风团消退持续一周未复发者15例，其中男性6例，女性9例，平均年龄(32.83±13.07)岁(20～61岁)。D组：健康对照组，为门诊体检血常规、肝肾功能、血糖血脂正常，既往无过敏性及系统性疾病健康者。15例，其中男性8例，女性7例，平均年龄(40.69±11.19)岁(22～58岁)。

1.2 主要试剂与仪器 荧光标记单克隆抗体：美国BECKMAN COULTER公司Anti-HLA-DR-PC5、CD123-ECD、CD63-FITC、CD 203c-PE ，流式细胞仪为美国BECKMAN COULTER NAVIOS流式细胞分析系统。

1.3 样本采集与测定

1.3.1 所有患者和健康对照者各抽血5 mL，静置后4000 r/min(r=10 cm)离心5 min，留取上清，及时检测。

1.3.2 标本处理分别向已编好号的试管中加入10 μL单克隆抗体；分别向试管中加入混匀的100 μL抗凝血；混匀，避光，室温孵育20～30 min；加入溶血剂500 μL，避光15 min；上机测样。

1.3.3 检测及分析 每次检测前均用Flow.Check荧光微球(Beckman Coulter)校准仪器，标本上机后，先以前向角散射光和侧向角散射光参数大致观察细胞形态，选取有核细胞，排除细胞碎片和杂质。选取CD123阳性而HLA-DR阴性的细胞即为嗜碱粒细胞，用CD63和CD203c双参数进行分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件处理，数据资料以(均数±标准误)表示，不同组间进行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FCM图表现 先选取CD123+HLA-DR-的外周血嗜碱粒细胞，再选取CD63+CD203c+活化的嗜碱粒细胞，结果表明A、B、C三组较D组嗜碱粒细胞CD63+CD203c+的荧光强度增加，阳性率增高。见图1。

2.2 四组嗜碱粒细胞CD63和CD203c表达情况 结果显示：与D组相比，A、B、C三组嗜碱粒细胞CD63和CD203c表达均显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)；A、B、C三组两两之间比较无显著差异(P>0.05)；具体结果见表1。

表1 CSU患者与健康对照组嗜碱粒细胞CD63+CD203c+表达情况

注：*A、B、C三组分别与健康对照D组比较，均P<0.05，有统计学意义；A、B、C三组间比较P>0.05，无统计学意义

图1流式细胞仪检测四组嗜碱粒细胞CD63和CD203c活化率

2.3 各组之间嗜碱粒细胞活化率情况，结果表明A、B、C组活化率明显高于D组，见图2。

图2 各组嗜碱粒细胞CD63和CD203c活化百分率散点图

3 讨论

CSU是一种全身性的炎症过敏性疾病，由于病因和发病机制不尽相同，风团持续时间也各不相同。部分患者风团持续<2 h能自行消退，也有患者风团持续12～24 h方可消退。在CSU，风团持续时间与患者生活质量密切相关，目前对于风团持续时间无明确划分标准，有分为<2 h和超过2 h者，以及<24 h和超过24 h者[5]。我们前期曾使用iTRAQ技术鉴定和验证了风团持续时间不同的CSU患者血清中差异表达的蛋白质，发现风团持续12～24 h组较<2 h组差异蛋白显著[6]，因此本研究沿用前期使用的标准，以风团持续时间<2 h、12～24 h和治疗后风团有效控制的CSU患者进行分组。

嗜碱粒细胞在慢性过敏性皮肤病中发挥着重要作用，与肥大细胞一样，也是CSU的主要靶细胞[7]。嗜碱粒细胞有多种表面标志物，CD63和CD203c作为嗜碱粒细胞的主要激活标记物[8]，基于其表达代表胞内两种不同的活化信号通路，且分别反映释放组胺的不同方式，因此利用流式细胞术联合检测胞膜CD63、CD203c可全面评估CSU患者嗜碱粒细胞活化情况。

既往研究表明，在CSU，外周血嗜碱粒细胞CD63和CD203c表达增加[9]，但表达水平与风团持续时间以及病情活动之间的关联尚不清楚。本研究结果显示，CSU风团持续时间不同的A、B两组和风团消退、病情暂时控制C组较健康对照D组嗜碱粒细胞CD63和CD203c表达均显著上调，这与Gentinetta等[10]、Yasnowsky等[11]研究结果一致，说明无论风团是否存在，活化的嗜碱粒细胞均参与疾病的过程。国内有学者发现嗜碱粒细胞在慢性荨麻疹患者显著高于急性荨麻疹患者[12]，亦有研究得出相反的结论[13]。嗜碱粒细胞在CSU风团形成过程中的作用机制与环节尚不明确，本组研究还比较了风团存在的A、B两组与风团暂时控制的C组嗜碱粒细胞CD63和CD203c的表达情况，结果显示A、B组两组与C组之间并无明显差异，提示活化的嗜碱粒细胞参与了具有炎症反应的风团形成过程。嗜碱粒细胞在慢性过敏性炎症反应中起着引发剂的作用，而并非单一效应物。嗜碱粒细胞浸润CSU患者的皮损中[14]，但嗜碱粒细胞的活化与风团持续时间无明显相关。在CSU的发病过程中，除了嗜碱粒细胞，还有其它因素使风团持续存在，如肥大细胞和自身免疫抗体等。本实验结果说明了活化的嗜碱粒细胞可能参与了风团的形成、发展，在风团消退病情暂时控制阶段嗜碱粒细胞也起到一定的作用，这为临床治疗CSU时抗炎药物选择的时机提供了帮助。

CSU发病机制复杂，本研究进一步提示，活化的嗜碱粒细胞参与了CSU的发病过程，但与风团持续时间长短无明显差异。由于本研究样本量较小，这一结果有待进一步证实。