杜仲皮水提物对虹鳟肌肉生肌调节因子家族（MRFs）基因表达的影响

■罗学评 张安青 袁国尚 姜海波，4* 文 明

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2.高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳550025；3.铜仁市农业农村局渔业技术推广站，贵州铜仁554300；4.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州贵阳550025）

虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是我国重要的冷水性经济鱼类。近年来随其人工繁育和养殖技术的不断成熟，养殖规模在不断扩大，然而高密度养殖模式下的虹鳟肌肉品质也随之下降。这成为限制虹鳟食用消费和加工利用的重要因素，制约了虹鳟养殖产业的健康、可持续发展。探寻改善虹鳟肌肉品质的方法已经成为学者的研究热点。鱼类肌纤维作为骨骼肌的基本构成单位，在某种程度上决定了肌肉的品质，其特征被普遍用于鱼肌肉品质的评定[1-3]。肌纤维（Myofiber）是由胚胎发育过程中分化出的肌源性祖细胞，分化形成单核的成肌细胞（Myoblasts），然后单核的成肌细胞融合，形成多核的肌管（Myotube），肌管之间再相互融合而形成。并伴随着一系列基因的表达变化。肌卫星细胞是一种特殊的肌源性干细胞，具有促进肌肉生长和自我修复的功能。而生肌调节因子家族（MRFs）在肌卫星细胞分化后期到肌管形成过程中发挥着关键的调控作用[4]。

MRFs 家族编码4 种肌肉特异性转录因子，分别是生肌决定因子（myogenic determining factor，MyoD）、肌细胞生成素（myogenin，MyoG）、生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）和生肌因子6（myogenic factor 6，Myf6），该家族控制着肌肉的发育，包括从前体肌细胞的定型、增殖及肌纤维的形成，直到个体出生后肌肉的成熟和功能的完善整个过程[5]。由此可见MRFs 的表达对肌肉品质的提升息息相关。杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)属杜仲科，杜仲属，具有很高的经济价值和药用价值[6]，是我国特有的经济物种，在我国也有着丰富的资源。在传统的中医学中，杜仲具有除腰膝酸痛，补肝肾，延缓衰老，强筋骨，改善糖代谢等功效[7-8]。目前，杜仲除在医学上得到广泛应用外，近年来在动物养殖业中的研究和应用也呈增加趋势，有关报道已见于草鱼[9-12]、鲤鱼[13]、异育银鲫[14]、罗非鱼[15]、猪[16-17]、鸡[18]等，这些研究表明杜仲具改善肌肉品质，提高动物生长性能，改善机体免疫等功效。本研究团队在前期的研究中发现饲料中添加1%、4%的杜仲皮水提物能显著降低虹鳟肌纤维直径，肌纤维的密度随着杜仲水提物浓度的增加而增大，0.5%、1%、2%、4%组的肌纤维密度均显著高于0%组[19]。本研究通过在虹鳟的基础饲料中添加不同浓度的杜仲皮水提物，分析其对虹鳟肌肉MRFs 基因表达的影响，以期从分子生物学方面初步探究杜仲皮水提物对肌纤维调控的机理，为杜仲作为水产动物肉质改良剂的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

基础饲料（山东升索渔用饲料研究中心生产的商业虹鳟饲料）含粗蛋白质为42.0%、粗脂肪为18.0%、粗灰分为8%、粗纤维为6%，经粉碎过40 目筛后称重备用。试验共设5 个处理组，在基础饲料中分别添加质量分数为0%（对照组）、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的杜仲皮水提物。试验用杜仲树皮采购于贵州省贵阳市援生医院（产地：四川省古蔺县），经研磨机制成粉末后过60 目筛网，分别称取杜仲皮粉末0、5.0、10.0、20.0 g 以及40.0 g 分别放入1 000 ml 的蒸馏水中煮沸4 h，经300 目尼龙滤网过滤，并将滤液浓缩至100 ml，得到水提物。将100 ml不同浓度杜仲皮水提物和300 ml 蒸馏水与1 kg 已粉碎的基础饲料混匀，经制粒机制作成直径1 mm的颗粒饲料，风干，保存在-20 ℃的密封塑料袋中备用。

1.2 试验用鱼的饲养管理

随机选取体质健康，大小均匀（145.56±4.12）g的虹鳟进行试验。试验分为5个处理组，每组3个重复，将15口网箱（规格1.0 m×1.0 m×1.2 m，有效水体积为600 L，每口网箱投放30尾虹鳟）分别置于3口室外流水水泥池内（流速为0.04 m/s，水温为12.8～14.1 ℃，溶氧浓度≥7.5 mg/l，氨氮＜0.05 mg/l，pH值7.6～8.4）。在自然光照条件下，养殖10周，每日投喂4次，缓慢投喂（每隔5 min 投喂一次），连续投喂至饱食为准。投喂时间分别为09：00、12：00、15：00和18：00。

1.3 样品采集

将养殖试验结束后的虹鳟饥饿24 h，每口网箱随机选取2 尾，用MS-222 麻醉后迅速在冰盘上进行解剖，取侧背白肌，放入液氮罐中，-80 ℃下保存备用。

1.4 样品总RAN的提取

总RNA 的提取参照RNA simple Total RNA Kit说明书进行。然后对所得总RNA 样品进行质量检测，用1.5%浓度的琼脂糖凝胶检测虹鳟肌肉组织总RNA 质量。根据28S 和18S 的亮度及比值判断RNA的完整性。微量核酸测定仪测量总RNA浓度以及波长为260 nm和280 nm的吸光度。

1.5 cDNA模板的合成

使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific™）对总RAN 进行反转录反应。提前将无菌无RNase污染的PCR管置于冰上，按照顺序加入表1 的反应物，将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心15 s，65 ℃孵育5 min，冰上冷却，离心15 s，再置于冰上冷却。再按顺序加入表2组分。轻轻混匀，离心15 s，放入42 ℃的水浴锅中孵育60 min。70 ℃加热5 min终止反应，反应产物可直接用于PCR反应或者在-80 ℃保存。

1.6 Real-Time PCR检测

从NCBI中下载虹鳟MRFs基因及内参基因β-actin 全序列，利用Primer 5.0 软件设计特异性引物（见表3，由上海生工生物工程技术有限公司合成）。以虹鳟肌肉中的cDNA 为模板，用设计好的引物进行Real-Time PCR 反应，检测虹鳟肌肉MRFs 转录水平。反应体系见表4，反应程序为：预变性95 ℃150 s；变性94 ℃15 s；退火58 ℃30 s；39循环。

表1 第一链cDNA合成体系(1)

表2 第一链cDNA合成体系(2)

表3 引物序列及扩增片段大小

表4 反应体系

2 数据统计与分析

用荧光定量PCR 方法检测不同浓度的杜仲水提物对MRFs 基因家族表达的影响，为了进一步清晰地表示出杜仲水提物添加组与正常对照组基因表达之间的关系，将对照组的基因表达量调整为1，用2-△△CT法计算MRFs 家族基因mRNA 的相对表达量，采用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan's法多重检验分析组间差异显著性，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

3 结果

3.1 虹鳟肌肉总RNA质量检测

对虹鳟肌肉总RNA 提取后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1，图1 中28 S 和18 S 条带清晰可见，且灰度值约为2:1，而5 S 带几乎没有，说明总RNA 无明显降解。利用微量核酸测定仪测定总RNA的纯度及浓度，结果显示浓度在200 mg/μl 以上，A260 nm/A280 nm 均 在1.90～2.10 之 间，未 检 测 到DNA及蛋白污染，说明提取的总RNA符合试验要求，可用于后续RT-PCR和qPCR反应。

图1 虹鳟肌肉总RNA的质量检测

3.2 MRFs和β-actin的普通PCR扩增摸索反应条件

用引物对虹鳟肌肉Myf6、Myf5、MyoD、MyoG和βactin 基因进行扩增，PCR 产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增片段与预期大小一致，条带单一且无非特异性扩增杂带及引物二聚体，说明可以用于荧光定量PCR的检测（如图2所示）。

图2 虹鳟肌肉Myf6、Myf5、MyoD、MyoG和β-actin基因扩增图

3.3 实时荧光定量PCR产物特异性分析(图3～图10)

经肌肉Myf6、Myf5、MyoD、MyoG基因和β-actin基因扩增曲线分析，扩增曲线均呈现“S”形，表明这五个基因动力学曲线平行性较好，曲线拐点清晰，基线平行无上扬趋势，最后进入平台期，表明稀释浓度合适。经溶解曲线分析，Myf6、Myf5、MyoD、MyoG基因和β-actin基因的溶解曲线只呈现一个标准的单峰，说明了扩增产物的特异性良好，没有出现其他的非特异性产物，其溶解温度分别为86.0、88.0、87.5、84.0 ℃和87.0 ℃。

3.4 杜仲水提物对虹鳟肌肉MRFs 相对表达量的影响

图3 β-actin与MyoD基因扩增曲线

图4 β-actin与MyoG基因扩增曲线

杜仲水提物对虹鳟肌肉Myf6、Myf5、MyoD 和MyoG 基因相对表达量影响的结果如图11～图14。各处理组之间肌肉Myf6、MyoD和Myf5基因表达量差异不显著（P＞0.05）。2.0%组肌肉MyoG基因表达量显著高于其他各处理组，4.0%组肌肉MyoG 基因表达量显著高于对照组、0.5%组和1%组（P＜0.05）。

图5 β-actin与Myf6基因扩增曲线

图6 β-actin与Myf5基因扩增曲线

图7 β-actin与Myf6基因溶解曲线

图8 β-actin与Myf5基因溶解曲线

图9 β-actin与MyoD基因溶解曲线

图10 β-actin与MyoG基因溶解曲线

4 讨论

生肌调节因子（muscle regulatory factors，MRFs）基因家族对肌肉的调控作用主要体现在对肌细胞命运的决定，成肌细胞增殖和分化、肌纤维的形成等方面。MRFs基因家族是1987年由Davis等首次发现[20]，而后Braun等[21]和Tapscott 等[22]根据人与小鼠MyoD的同源性，于1989年从人类胎盘的骨骼肌cDNA文库中分离得出（myogenic determining factor，MyoD）、生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）、肌细胞生成素（myogenin，MyoG）和生肌因子6（myogenic factor 6，Myf6），它们是控制骨骼肌生成的关键调节因子，共同控制肌肉的生成[23]。

图11 杜仲水提物对虹鳟肌肉Myf5 mRNA表达的影响

图12 杜仲水提物对虹鳟肌肉Myf6 mRNA表达的影响

图13 杜仲水提物对虹鳟肌肉MyoD mRNA表达的影响

图14 杜仲水提物对虹鳟肌肉MyoG mRNA表达的影响

本研究发现2.0%和4.0%组的MyoG mRNA 表达显著高于对照组。MyoG 作为骨骼肌分化所必需的因子，它是MRFs 基因家族中唯一能够在所有骨骼肌细胞中均表达的基因，且在肌细胞的形成过程中具有中心调控作用，它与肌纤维的直径、大小、数量以及密度密切相关[24]。MyoG 基因通过控制成肌细胞的融合和肌纤维的形成来对肌肉的分化作用产生影响，其对脊椎动物肌细胞分化和骨骼肌系统的发育成熟具有重要意义[25]。Hasty 等[26]的研究表明，MyoG基因敲除的小鼠出生后会发生严重的骨骼肌发育缺陷，说明该基因对骨骼肌的形成有重要的作用。MyoG 基因可以调节自身表达，也可以与其他成员相互作用，彼此调节。当胚胎干细胞中缺失MyoG 时完全分化的肌纤维由过量表达的Myf6 产生[27]。但是，MyoG 调控着中胚层细胞分化为成肌细胞，再由成肌细胞融合为肌纤维[28]，这是一个不可替代过程。本研究还发现各组之间Myf5、MyoD 和Myf6 mRNA 表达量无显著差异，但2.0%和4.0%组Myf6 mRNA 的表达量变高于对照组，这一变化趋势与MyoG 基因变化相似。根据结构及功能的不同，将MRFs 基因家族分为两类，初级MRFs 和次级MRFs。初级MRFs 主要指Myf5 和MyoD，两者同源性较高，且在成肌分化中两基因在功能上存在互补。当阻隔MyoD 表达时Myf5会发生代偿性高表达，骨骼肌仍能发育；当阻隔Myf5 的表达，则不能生成早期的肌节，但随后MyoD会被激活而表达，肌肉仍可形成；若Myf5 和MyoD 均缺失，则无前体成肌细胞生成，个体将无法产生肌肉[29]。次级MRFs 为MyoG 和Myf6（MRF4）。它们在Myf5和MyoD 的下游表达，在肌细胞的终末分化以及肌纤维成熟及维持方面起作用[30-31]。若缺乏MyoG，则无肌纤维形成；若缺乏Myf6，个体虽能够形成骨骼肌，但会因为肋骨发育缺陷，在出生时就死亡[32]。有研究表明MyoG 基因主要在胚胎骨骼肌发育阶段调控肌管的形成方面有重要作用，而Myf6 则是促进肌纤维的形成以及与肌肉的分化状态有关[33]，两者之间具有是相辅相成，相互促进的作用。本研究中2.0%和4.0%组的Myf6 和MyoG mRNA 的表达均高于对照组，可能是由于Myf6 和MyoG 基因相互促进作用而引起的。

5 结论

饲料中添加杜仲水提物对虹鳟肌肉MyoD、Myf6和Myf6 mRNA 表达无显著影响，但添加2.0%和4.0%的杜仲水提物可以显著提高虹鳟肌肉MyoG基因表达量。杜仲皮水提物可通过调控虹鳟肌肉MyoG基因的表达以实现肉质改善。