山羊痘病毒与小反刍兽疫病毒双重PCR 检测方法的建立

王璐瑶，宫英阑，郝雪飘，王建昌，张若曦，袁万哲，4

（1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071001；2.河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北石家庄 050051；3.河北省动物疫病预防控制中心，河北石家庄 050035；4.河北省兽医生物技术工程技术研究中心，河北保定 071001）

羊痘又名“羊天花”，是由羊痘病毒属病毒引起的一种热性、急性、接触性羊传染病，被我国列为一类动物疫病，被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病。山羊痘病毒（goat pox virus，GTPV）是羊痘病毒属中的一种。羊痘的典型症状为发热、呼吸急促、鼻腔流黏液性鼻涕、在无毛或少毛部位皮肤发生丘疹和疱疹。易感羊群的羊痘病死率在10%～100%之间，羔羊病死率可高达100%，怀孕母羊会极易发生流产情况，同时也会导致羊群生产力和羊毛品质大幅降低。因此，羊痘给养羊业带来巨大的经济损失，对国际贸易和养羊业的发展也有严重影响[1]。

小反刍兽疫又名“伪牛瘟”，是由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一种急性（亚急性）、热性、传染性小反刍动物疾病。其典型症状为发热、眼睛和鼻腔分泌物增多、腹泻、呼吸异常、口腔内出现坏死性病灶等，发病率在80%～90%之间，死亡率在50%～80%之间，有时可高达100%[2]。小反刍兽疫病程急，主要感染绵羊和山羊，严重阻碍养羊业发展。因此，我国将小反刍兽疫也列为一类动物疫病，OIE 同样将其列为须通报动物疫病[2]。

当羊群感染羊痘或小反刍兽疫时，均有发热、眼鼻分泌物增多、皮肤发生疤疹和溃疡等相似特征性症状，单从临床症状上难以将其区分与确诊。这两种疫病一旦发生，无论哪一种都会对养羊业造成严重影响。因此，建立一种快速、准确、方便的检测方法，对羊痘和小反刍兽疫的诊断与防控非常重要。目前，常规PCR 方法无法对这两种病原在同一体系内同时进行检测。本研究通过对PCR 反应体系和反应条件进行优化，建立了山羊痘和小反刍兽疫双重PCR 检测方法，为山羊痘和小反刍兽疫的临床诊断、疫情监测、流行病学研究提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 GTPV：从山羊痘活疫苗（痘必应）中获得，购自哈药集团生物疫苗有限公司；PPRV：从小反刍兽疫活疫苗中获得，购自天康生物股份有限公司；羊口疮病毒（ORFV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）：由河北农业大学动物医学院实验室保存并提供。

1.1.2 仪器设备与主要试剂 TGL-16 台式高速冷冻离心机：购自湖南塞特湘仪离心机仪器有限公司；PCR 仪：购自北京鼎昊源科技有限公司；DYY-6C型电泳仪：购自北京六一仪器厂；凝胶成像系统GB0X-F3：购自美国基因有限公司；DNA/RNA 柱提法提取试剂盒：购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司；EasyScript® RT、Ribonuclease Inhibitor：由全式金生物技术有限公司生产提供。其他试剂还包括，10×Buffer、rTaq酶、DL 2 000 bp DNA Maker。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank 上登录的PPRV、GTPV 两种病毒的基因序列，由上海生工生物工程有限公司扩增PPRV 和GTPV 的PCR 引物，所有序列见表1。

表1 引物序列及扩增目的基因长度

1.2.2 病毒核酸提取 根据DNA/RNA 柱提法提取试剂盒（哈尔滨国生生物科技股份有限公司）说明书，提取羊痘疫苗总DNA 与小反刍兽疫疫苗株的总RNA，置于-20 ℃备用。

1.2.3 病毒RNA 反转录 对小反刍兽疫疫苗株总RNA 进行反转录。20 μL 体系如下：RNA 10.5 μL、下游引物 2.0 μL、5×ES Buffer 4.0 μL、dNTPs 2.0 μL、ESRT 1.0 μL、RRI 0.5 μL。按 以上顺序，用移液枪将其加入1.5 mL 离心管内，然后放入42 ℃水浴锅内反转录1 h，得到的产物为PPRV 的cDNA。

1.2.4 常规PCR 检测 对提取的GTPV DNA和PPRV cDNA 分别进行PCR 扩增。PCR 体系（20 μL）为：上下游引物各0.5 μL，dNTPs 1.6 μL、10×Buffer 2 μL、rTaq酶0.1 μL、模 板2 μL，ddH2O 13.3 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。两个基因所用PCR 程序相同，PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 双重PCR 条件优化 使用超微量分光光度计，对GTPV DNA 与PPRV cDNA 浓度分别进行检测，发现GTPV DNA 浓度为28.3 ng/μL，PPRV cDNA 浓度为645.9 ng/μL。由于核酸浓度差距较大，将模板与引物比例进行了优化，具体见表2。将提取出的GTPV DNA 和PPRV cDNA 进行双重PCR，在20 μL 体系中，按表2 中的引物比例，加入4 条引物以及dNTPs 1.6 μL、10×Buffer 2 μL、rTaq酶0.1 μL；模 板GTPV DNA 与PPRV cDNA按照表2 中比例加入，用ddH2O 补齐至20 μL。按上述PCR 程序进行PCR 扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.2.6 特异性检测 通过对GTPV 的DNA、PPRV 的cDNA、ORFV 的DNA、BVDV 的cDNA，按照上述方法进行双重PCR，检测该方法的特异性。

1.2.7 敏感性检测 将提取的GTPV DNA 和PPRV cDNA 混合后进行10 倍系列稀释，通过上述双重PCR 优化好的体系与程序进行PCR 扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳。

表2 体系中模版与引物的用量 单位：μL

2 结果与分析

2.1 常规PCR 鉴定

使用常规PCR 方法，对PPRV 和GTPV 进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现PPRV 阳性样本扩增条带大小为385 bp，GTPV 阳性样本扩增条带为969 bp，均与预期条带大小相符（图1）。

图1 常规PCR 检测结果

2.2 双重PCR 模板与引物比例优化

将模板与引物，按照不同比例进行PCR 反应，并在1%琼脂糖凝胶进行电泳。由图2 可知，模板GTPV 与PPRV 之间最适比例为4:1，引物最适比例为17:3。

2.3 双重PCR 特异性检测

按照双重PCR 优化条件，将含有GTPV 和PPRV 核酸样品的混合物以及GTPV、PPRV、ORFV、BVDV 进行特异性检测，经1%琼脂糖凝胶电泳扩增出与预期目标相符的969 bp 和385 bp目的片段，而其他病原未出现条带（图3）。

图2 模板与引物条件优化结果

图3 特异性检测结果

2.4 双重PCR 敏感性检测

用超微量分光光度计测得的GTPV DNA 浓度为28.3 ng/μL，PPRV cDNA 浓度为645.9 ng/μL。条件优化后，对GTPV DNA 与PPRV 反转录产物混合后，作10 倍系列稀释，结果发现，GTPV 的最低检出量为0.283 ng/μL，PPRV 的最低检出量为6.459 ng/μL（图4）。

3 讨论

羊痘初期可能只是个别发病，但其流行非常快，后期会很快诱发全群感染[3]。我国山羊痘和绵羊痘疫情主要发生于新疆、甘肃、宁夏、青海、陕西、福建、贵州等地，对我国养羊业的健康发展影响严重。伴随着国际贸易日益频繁，该病在近年来流行范围有逐步扩大的趋势[4]。为降低羊痘带来的巨大经济损失和公共卫生安全问题，建立一种快速、高效、准确、操作方便、成本低的检测方法具有重要意义。

近年来，小反刍兽疫发生也呈上升趋势，在多个国家和地区不断蔓延。2007 年小反刍兽疫首次传入我国西藏地区。此后，国内其他地方陆续报道发现该病。因此，掌握 PPRV 快速准确的检测技术，对了解该病的国内流行状态和对该病的防治工作有重大意义[5]。

图4 敏感性检测结果

目前，对于临床症状相似的病毒性疾病，如羊痘和小反刍兽疫，仅通过简单的临床检查很难作出准确判断，有可能导致误诊，从而影响最佳防治时间。因此，在这种情况下，通过PCR 技术可以准确确诊疫情。多重PCR 技术是在传统PCR技术基础上进行优化改进的一种新技术，比传统PCR 技术具有更高效、更经济方便等优点。在一个多重PCR 反应体系中，影响检测结果的主要因素是不同基因的引物浓度、退火温度、底物浓度是否达到平衡。在建立多重PCR 反应体系时，需要不断优化多重PCR 不同基因的引物浓度，因为不同基因引物的浓度搭配会影响相应基因的扩增量。调整体系中各种引物比例，可增加难扩增基因的引物量，减少易扩增基因的引物量[6]。本研究中就遇到了类似问题，需要对引物浓度和核酸模板浓度比例进行优化。因此，在研究中合理设计引物、优化最佳多重PCR 体系及反应条件，可增加其灵敏度和特异性，减少出现非特异性扩增、假阴性、假阳性概率[7]。研究人员可以在每次试验中设立严格的阴阳性对照，防止非特异性扩增，减少假阴性、假阳性对结果的影响。

在以后的试验中，将进一步开展所建立方法对临床样品检测应用研究，提高该方法的实用性。

4 结论

本研究在GTPV 和PPRV 常规PCR 的基础上，建立了双重PCR 的方法。通过敏感性和特异性试验，证实该方法可同时完成PPRV、GTPV 两种病原的检测，可用于疫病的临床鉴别与诊断。本研究建立的双重PCR 方法对于这两种疫病的临床检测与防控提供了有力技术支撑。