逆流色谱在外消旋体分离中的应用

竺少铭，胡珊姗，王红卫，孔望欣

（浙江医药股份有限公司昌海生物分公司，浙江 绍兴 312366）

0 引言

目前临床上使用的很多药物属于手性药物的消旋体，但手性药物的不同对映体与生物大分子的作用表现不同，从而在机体内产生不同的药理、毒理、药代、药效作用。服用单一对映体可以减少药物剂量和人体代谢负担，减少与其他药物的相互作用，提高活性并降低由某对映体产生副作用的可能性。现有的1327 种合成药物中含有手性中心的有528 种，接近40%，然而以外消旋体形式销售的手性药物几乎高达80%。美国食品和药物管理局（FDA）于1992 年规定，今后凡发展具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分的结果。为了能准确地了解药效和安全用药，发展和建立简单快速的手性药物对映体的分离分析方法，并用于临床研究和医药质量控制，已成为医药界关注的重大课题。获取手性药物单一对映体的方法有外消旋体的拆分和不对称合成（生物合成也算作不对称催化合成）。由于不对称合成的合成步骤烦琐、反应条件苛刻，外消旋体药物或中间体的拆分成为获取单一对映体的主要方法。外消旋体的拆分包括化学拆分、酶法拆分、色谱拆分和膜分离拆分。色谱分析技术是目前分离消旋体的主要方法之一[1-2]。采用HPLC 技术进行手性异构体的分离，需要将手性选择试剂（CS）通过化学的手段键合在一种固体介质上作为HPLC 分离的固定相，这种手性分离柱的制备价格昂贵，且需要一个费时且复杂的过程；同时采用HPLC 法进行制备性分离的溶剂消耗量也很大。因此寻求高效廉价的手性分离分析新方法成为研究的热点。

逆流色谱作为色谱技术中的一种，起源于逆流分溶法。在20 世纪80 年代随着流体静力学平衡系统（HSES）和流体动力学平衡系统（HDES）的提出而取得了很大的突破[3]。在HDES 基础上，Conway W D 等在实验室发现单侧HDES 现象[3-4]。高效逆流色谱仪的出现得益于单侧HDES 现象的发现[5]。1994 年Ito 博士提出了新的CCC 技术，pH 区带逆流色谱和离子对逆流色谱[6]，使逆流色谱技术有了长足发展。

高速逆流色谱不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，更能反映其本来的特性，适合于天然生物活性成分的分离，而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备效率大大提高，是一种理想的制备分离手段。逆流色谱应用于手性化合物的分离，不需要采用化学手段将手性试剂键合到固体介质上，同一根逆流色谱分离柱可以反复多次地用于不同手性化合物的分离，只需选择合适的两相溶剂体系和手性试剂即可，在拆分外消旋体时避免了不可逆吸附引起的溶液和昂贵样品的损失。相对于传统的色谱拆分手段，高速逆流色谱具有适用范围广[7]、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。

1 逆流色谱手性分离原理

由于逆流色谱技术与一般液相色谱的主要区别是不用填料作为固定相，这与普通HPLC 相比是完全不一样的：手性试剂不需要涂敷或键合到固体填料上，因此手性识别机理存在一定差异。

目前，色谱法分离外消旋体一般采用两种形式：直接法和间接法。间接法是使对映异构体先与一种光学纯的试剂反应，生成非对映异构体，然后在非手性的环境下进行分离；直接法即采用手性固定相或手性添加剂直接对异构体进行分离和测定。直接法因简便、快捷而在色谱分离手性药物上面应用更广泛[8]。

逆流色谱拆分消旋体一般采用的是直接法，即在逆流色谱的固定相或者流动相中分别添加手性试剂（疏水性和亲水性手性试剂的结合）来实现手性化合物的拆分和分离，主要分为单相识别模式和双相识别（固定相Stationary phase/流动相Mobile phase Recognition，简 称S/M 识 别）模式。手性选择剂和对映体之间通过氢键、偶极-偶极、π-π、疏水作用和空间作用等结合，从而在两相间的分配系数不同（亲和力不同），达到分离手性药物的目的。

1.1 单相识别模式

单相识别：即仅仅在固定相中添加手性试剂或仅仅是手性流动相添加剂法，但事实上由于CCC 分离柱的理论塔板远小于HPLC 分离柱，单一的在固定相或在流动相中添加手性试剂的方法对于CCC 来说很难取得良好的分离效果。

以有机固定相中添加手性试剂为例，高速逆流色谱手性分离单相识别原理如图1 所示：

图1 高速逆流色谱手性分离单相识别原理示意图Fig.1 Schematic diagram of chemodynamic equilibrium between the racemates（A±）and chiral selector（CS）in the separation column based on monophasic recognition

从图1 中可以看出，在固定相中对映体（A+和A-），手性选择剂（CS）与它们的结合物（CSA+和CSA-）保持动态平衡。同时对映体（A+和A-）各自在固定相和流动相中保持平衡。可以得到下列表达式：

其中，A+—表示右旋体；A-—表示左旋体；A+，-—表示外消旋体；D+—表示A+在有手性添加剂的情况下的分配系数；D-—表示A-在有手性添加剂的情况下的分配系数；D0—表示A+，-在没有手性添加剂的情况下的分配系数；Kf+—表示在化学计量比为1∶1 情况下结合物CSA+的形成常数；Kf-—表示在化学计量比为1∶1 情况下结合物CSA-的形成常数。

从上述表达式可以得到：

则对映体的分离因子α：

式（8）表明对映体的分离因子α 随着手性选择剂的浓度（[CS]）和Kf+／Kf-比值的增加而增加。由于与手性添加剂（CS）结合能力的不同，左旋体和右旋体在两相体系中分配系数的差异引起分离因子变化，实现对映体分离。

事实上，由于CCC 分离柱的理论塔板远小于HPLC 分离柱，单一的在固定相或在流动相中添加手性试剂的方法对于CCC 来说很难取得良好的分离效果。

1.2 双相识别模式

双相识别：即在逆流色谱的固定相和流动相中分别添加不同的手性试剂来研究手性化合物的分离。HSCCC 双相识别原理如图2 所示：

图2 双相识别逆流色谱原理图Fig.2 Schematic diagram of chemodynamic equilibrium between the racemates（A±）and chiral selector（CS）in the separation column based on biphasic recognition.

从图2 中可以看出，对映体（A+和A-），两种不同手性选择剂（[CS]org和[CS]aq）与它们的结合物（[CSA+]org、[CSA-]org和[CSA+]aq、[CSA-]aq）分别在固定相和流动相中保持动态平衡。同时对映体（A+和A-）各自在固定相和流动相中保持平衡。

相比于单相识别模式，双相识别模式中，对映体的分配系数表示如下：

对映体的分离因子α：

Kf+—表示在化学计量比为1∶1 情况下结合物[CSA+]org在有机相中的形成常数；Kf-—表示在化学计量比为1∶1 情况下结合物[CSA-]org在有机相中的形成常数；K′f+—表示在化学计量比为1∶1 情况下结合物[CSA+]aq在水相中的形成常数；K′f-—表示在化学计量比为1∶1 情况下结合物[CSA-]aq在水相中的形成常数。

在流动相中添加手性选择剂，通过流动相手性选择剂的辅助识别能力，在表观上增大了固定相手性选择剂对对映体的选择性，使得分离选择性系数增大。流动相中添加的手性选择剂与对映体产生一种竞争吸附，能够显著改变外消旋体不同对映体与固定相手性选择剂之间的分子间作用力，最终导致分离度增加。在双相识别体系中，对映体的分离因子α 和亲水性手性选择剂的浓度（[CS]aq）、亲脂性手性选择剂的浓度（[CS]org）和Kf+／Kf-比值以及K′f+／K′f-比值有很大关系，随着这些因素增加而增加。所以添加合适的手性选择剂和选择合适的两相溶剂系统，对于成功分离外消旋体十分重要。

2 逆流色谱手性系统的选择

2.1 两相溶剂系统的选择

溶剂体系的选择对于HSCCC 十分重要，两相溶剂应该满足以下要求[9]：（1）为了保证必要的固定相保留值（体积比不小于50%），溶剂体系的分层时间应小于30 s；（2）目标样品的分配系数K若接近于1，容量因子应大于1.5；（3）尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理及易于物质的纯化；（4）不造成样品的分解或变性，且对样品有足够高的溶解度。

目前用的最多和比较适合的是两种溶剂系统：正己烷/乙酸乙酯/正丁醇/甲醇/水，氯仿/甲醇/水。对于一种未知的样品，Ito 认为可以选择一种应用较为成熟的溶剂系统，例如先采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（1∶1∶1∶1）或氯仿/甲醇/水（10∶3∶7）进行尝试，再根据目标组分的分配系数调整溶剂的组成[10]。如果需要亲水性更强的体系，加入盐（醋酸铵）或酸（三氟醋酸或醋酸）。还有人提出正丁醇/乙酸乙酯/水（3∶2∶5）适用于分离极性大的物质，而正庚醇/乙酸乙酯/甲醇/水（6∶1∶6∶1）适用于弱极性和非极性体系[11]。

常用溶剂体系的选择首先根据样品的理化特性选出最佳溶剂，再选择相应的数种溶剂，以组成选择性最好的多元溶剂体系[12]。

2.2 添加手性选择剂

在添加手性选择剂时，手性选择剂应满足以下要求：①能够完全溶解在溶剂中或混合溶剂中；②在液相溶剂中能够保持对对映体的识别能力。一般地，手性选择剂加入由有机溶剂或混合溶剂组成亲脂固定相中，亲水性溶剂或水溶液作为流动相。

筛选合适手性选择剂方法：（1）从手性试剂的萃取拆分研究以及借鉴气、液、毛细管电泳中广泛使用的手性添加剂，找到适合于逆流色谱的手性添加剂，是一个很好的途径，这类手性选择剂有离子对试剂、配体交换试剂、蛋白质亲和试剂、环糊精及冠醚包合试剂和手性氢键作用试剂等。如环糊精及其衍生物，冠醚包合试剂已经用在分离扑尔敏、氨鲁米特等手性药物逆流色谱中。（2）按照交互作用原理选择手性选择剂：如果化合物A 的对映体之一能够拆分化合物B 的对映体，则化合物B 的单一对映体能够拆分A 的对映体。目前人们尝试以大环分子类的环糊精及其衍生物、冠醚及其衍生物，天然多糖衍生物，蛋白质和氨基酸作为手性选择剂，在拆分消旋体方面取得了成功。其中CCC 手性分离中应用比较成功的手性选择剂主要有三类：L-脯氨酸衍生物、磺化β-环糊精类和大环抗生素（万古霉素）类。

2.2.1 以大环分子作为手性选择剂

2.2.1.1 环糊精及其衍生物

组成环糊精的每个葡萄糖单元有5 个手性碳原子，因而作为主体分子，能够提供客体分子一个良好的不对称环境，由于独特的结构，环糊精能选择性地包结多种客体分子，形成具有不同自由能的包结物。作为手性选择剂，客体分子的作用行为将呈现差别，若客体分子是一对对映体，则将形成非对映体的包结物，呈现对映体选择性，这是环糊精拆分对映体的主要依据。

环糊精取代基的位置及引入基团的性质将深刻影响改性后的环糊精的各种性状，成为影响其手性选择性的主要因素[13]。研究结果表明，如果分子中的手性中心与伯氨基邻近，可获得最佳的分离效果[14]。环糊精外部羟基衍生化，羟基被羧甲基、甲基等基团取代，取代基具有双重作用，在空间上扩大或缩小环糊精手性腔的大小，改变包结作用能力；同时，由于引入新的基团可发生p-p相互作用，氢键和偶极叠合的功能，因此，增加新的拆分作用点，两者均导致选择性的显著变化。化学修饰环糊精可改变天然环糊精的理化性质，改变手性选择性，环糊精衍生物分离手性物质的成功在HPLC，CE 和GC 有过很多报道[15-17]。

Breinholt J 等[18]采用硫酸化的β-环糊精作为选择剂去分离7-去甲基-奥美昔芬。首次介绍了环糊精衍生物作为手性选择剂成功应用于逆流色谱分离外消旋体。

刘佳川[19]尝试在高速逆流色谱中以环糊精及其衍生物作为手性选择剂，对15 种药物进行筛选拆分，发现水溶性的羧甲基β-环糊精能够拆分手性药物氨鲁米特和扑尔敏，并建立了制备性分离氨鲁米特的分离方法。溶剂系统选择乙酸乙酯/甲醇/水的比例为10∶1∶9 或10∶2∶8 对氨鲁米特能拆分，且比例为10∶1∶9 拆分效果比较好。

Ai P 等[20]选择20 mmol/L 羧基羧甲酯-β-环糊精作为手性选择剂添加到流动相中，用乙酸乙酯：甲醇：水=10∶1∶9 作为两相溶剂系统，分离1.2 h，消旋体能得到有效的分离。

Tong S Q 等[21]作了高速逆流色谱双相识别模式分离α-环己基扁桃酸外消旋体的研究。两相溶剂系统选择正己烷/甲基叔丁基醚/磷酸盐溶液（9∶1∶10），添加0.3 mol/L（-）-2-乙基己基酒石酸盐在有机固定相中，添加0.1 mol/L 羟丙基-β-环糊精于流动相中，在温度为8 ℃，流动相pH=2.68，样品在带260 mL 柱容积的CCC 制备仪中最大量为440 mg，在这种分离条件下，分离效果最好。分离物的纯度可以达到99.5%以上。除掉CS 得到目标化合物，可以达到85%～88%。最终右旋对映体得到186 mg，左旋对映体得到190 mg。

2.2.1.2 冠醚及其衍生物

冠醚的结构是一种有亲水性的内腔和疏水性的外壳，一般是引入一些手性单元作为手性选择剂。目前常用的是18-冠-6-醚类，它主要用于分离一级胺，尤其是氨基酸及其衍生物的分离（醚环上的氧原子和氮原子上的氢原子形成氢键，4 个手性碳上的羧基向两侧交叉对应形成位阻，静电作用和位阻作用使对映体与冠醚形成有差异的主客体）。但一级胺必须质子化方能达到分离，因此流动相必须是酸性的。

Kim E 等[22]研究应用（+）-（18-冠-6）-四甲酸作为手性选择剂，分离吉米沙星对映体。溶剂的疏水性增加，吉米沙星单一对映体的分离度相应的增加。所以选择了1-BuOH∕EtOAc/20 mol/L双三羟基甲氨基醋酸盐缓冲液，比较适合。较高的pH 与吉米沙星有很强的相互作用，也能使冠醚去质子化。选择最优的溶剂的pH，以及合适选择剂含量，也能提高其分离度。在pH 为6 时，吉米沙星单一对映体的分离度最高，比应用毛细管电泳（最适宜pH 为4.5）时还要好。

冠醚的优点为在一定条件下能够对伯胺类对映体快速直接分离，无需衍生化。但冠醚的分离能力受浓度的影响大，且毒性较大，柱效相对较低，其应用受到一些限制。

2.2.2 以天然的多糖衍生物作为手性添加剂

这类物质以糖苷键相连，具有螺旋结构和沟槽，从而有吸附和包结的作用，并且容易获取。衍生化能够提供各种作用位点，容量大适合制备型色谱。目前一般是引入3，5-二硝基取代基。

Perez E 等[23]应用纤维素和直链淀粉的苯基酰胺（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）衍生物作为逆流色谱的手性选择剂，采用传统洗脱方式和pH区带逆流色谱，尝试用几种有机/水两相溶剂系统分离8 种分别显酸性、中性和碱性的目标样品。最后发现在甲基异丁基酮（MIBK）/水溶液或甲基叔丁基醚（MTBE）/水溶液两相体系下，对心得静（一种血管舒张药）和杀鼠灵两种药物分离较为理想。心得静在两相体系为甲基异丁基酮（MIBK）/水溶液，固定相为10 mol/L 二乙醇胺（DEA）以及7.5 mg/mL 纤维素衍生物，流动相为H2O（HCl 5 mol/L）的情况下，右旋对映体的纯度可以达到92%，左旋对映体的纯度可以达到85%。杀鼠灵在两相体系为甲基叔丁基醚（MTBE）/水溶液两相体系下，固定相10 mol/L 三氟乙酸（TFA）以及7.6 mg/mL 直链淀粉衍生物，流动相为H2O（2.5 mol/L NH4OH）的情况下，右旋对映体的纯度可以达到89%，左旋对映体的纯度可以达到97%。可以发现在最好的分离条件下，两种药物的分离度都能够达到84%～97%。

Perez E 等[24]也作了关于使用纤维素的衍生物作为手性选择剂应用于逆流色谱的研究，经过化学改性，纤维素作为手性选择剂分离外消旋体有很好的效果，已经被广泛地应用。目前多糖类衍生物作为手性选择剂时手性识别能力较强，方法也较为成熟。

2.2.3 蛋白质和氨基酸

目前用的较多的是L-脯氨酸衍生物，一般是至少引入一个3，5-二取代基芳香环，包括有硝基、氯代或甲基基团[25]。蛋白质和对映体的作用主要为疏水和静电作用。

Delgado B 等[26]通过比较N-十二烷酰基-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺及其衍生物作为选择剂时分离消旋体结果，发现在其结构中引入一个π电子供应基团，对其手性选择有积极作用，但是这些改性可能降低其在亲脂性溶剂中的溶解度，可能限制制备目的的适用性。L-脯氨酸衍生物作为手性选择剂，有更强的手性选择性。醋酸铵缓冲液保留时间较磷酸盐缓冲液大，酸化溶剂体系，能够使N-二硝基苯-L-亮氨酸在有机固定相中的分离度更高，从而增加被分析物的保留和分离。

Ma Y 等[27]研究应用高速逆流色谱以L-脯氨酸的衍生物N-十二烷酰基-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺作为手性选择剂对（±）-二硝基苯氨基酸消旋体进行拆分。通过比较常规和pH 区带逆流色谱两种拆分技术分离外消旋体的结果，发现应用pH 区带逆流色谱分离消旋体的效果较好。使用常规技术，在2～9 h 的时间内，10 mg 到最多1 g的样品能够得到分离；而pH 区带色谱中，在少于3 h 的时间内，超过2 g 的样品得到了有效地分离。

Ma Y[28]用高速逆流色谱进行制备规模的分离手性化合物获得了成功，并且申请了专利。在这项研究中，使用了带有325 mL 容量柱的多层线圈行星离心仪，以N-（3，5-introbenzoyl）-D，Lamino acids 为样品，N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺作为手性选择剂，溶剂系统选择正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水，对目标样品进行了拆分。第二种操作采用pH 区带逆流色谱，两种异构体的特征矩形峰的重叠小于5%。

Pérez A M[29]做了关于氟化的手性选择剂L-脯氨酸的衍生物在逆流色谱分离旋光对映体中应用的研究。在这项研究中，描述了在CCC 中应用良好、在室温下十分稳定的溶剂系统，即一种氟化的溶剂乙氧基诺娜氟丁烷（ENFB），发现ENFB/2-PrOH/H2O（25∶35∶40）混合液较为适合分离DNB-Leu 和DNB-Leu-tBu。该研究表明，这种氟化的手性选择剂在分离非电离手性化合物方面具有应用前景，开发了一个新的应用领域。

蛋白类作为手性选择剂在CCC 手性分离外消旋体中应用广泛，拆分效果也较好。但蛋白质只能与具有特定几何构型和化学官能团的分子结合，拆分一些特定的消旋体。

2.2.4 其他

Rubio N 等[30]研究用（S）-萘普生衍生物（S）-N，N-二乙基胺萘普生作为手性选择剂，运用多重双模逆流色谱进行手性分离（±）-N-（3，4-顺-癸基-1，2，3，4-四氢化菲-4-）-3，5-二硝基苯酰胺和N-（3，5-二硝基苯甲酰）-（±）-亮氨酸。

Franco P 等[31]研究用金鸡纳属生物碱衍生物作为逆流色谱手性选择剂分离N-氨基酸衍生物和2-芳氧基丙酸，并找到了合适的手性系统。醋酸铵缓冲液/叔戊醇/甲醇/庚烷，特别是醋酸铵缓冲液/甲基异丁基醚或二异丙基醚非常适合对消旋体进行分离。

3 展望

逆流色谱作为一种不用固态载体能实现连续有效分离的色谱技术，在手性药物的分离分析方面有很大的应用前景。手性分离技术已经在高压液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）和毛细管电泳（CE）中得到广泛应用，但在逆流色谱中应用很少。与其它色谱新技术相比，逆流色谱存在一些不足，在拆分外消旋体方面还有待于普及和推广。随着逆流技术的迅猛发展，逆流色谱在手性分离中的应用会日趋成熟。目前主要困难在于选择适合的手性添加剂，近年来人们选用一些常用的手性选择剂去分离手性药物，例如冠醚被用来分离含有氨基的一类药物，一些源自HPLC 技术的手性选择剂如N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺和β-环糊精等，应用到逆流色谱分离外消旋体中也取得很好的效果。在这些手性选择剂中，L-脯氨酸类和环糊精类在逆流色谱分离外消旋体的应用方面比较广泛，技术相对成熟，且这两类成分为天然物质，低毒，价格低廉，是未来逆流色谱手性选择剂发展方向。相信随着研究的深入，逆流色谱会在外消旋体分离分析方面有着更加广泛的应用前景。主要通过手性系统的研究开发，不断发现新的手性选择剂和溶剂系统，提高分离效率。同时也应做深入的基础性研究，为逆流色谱手性分离技术的不断发展和创新提供理论基础。