精血补片HPLC指纹图谱建立同时测定主要成分含量*

宁良琦，郑艳萍，蔡宝昌，童黄锦

1 安徽亳州市食品药品检验中心，亳州 236803；2 南京海昌中药集团有限公司，南京 210061；3 南京中医药大学附属中西医结合医院，南京 210028；4 江苏省中医药研究院，南京 210028

精血补片，别名益脑片，由生晒参、红参、制何首乌、紫河车、五味子、陈皮等6 味中药配伍组成的非处方中成药，具有补肝肾、益血气、养心神的疗效，用于神经衰弱、精神萎靡、头晕目弦、心悸失眠等症[1]。该品在部颁标准《中药成方制剂》第六册（WS3-B-1268-92）中只规定了性状、显微鉴别、检查3 项内容，并未涉及有效成分含量测定等重要检验项目。查阅相关文献发现，仅有2 篇报道精血补片质量控制方面的研究[2，3]，涉及了薄层色谱法（TLC）对复方制剂中各味中药进行定性鉴别和二苯乙烯苷含量测定的方法，不能全面反映精血补片复方制剂多成分共同作用的特征。故制定有效的质量标准是中药安全有效的必由之路，可以反映中药及其制剂中所含化学成分的种类及数量。

本文采用HPLC 法对精血补片进行系统研究，建立其指纹图谱及橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黄素等4 种成分含量测定方法，为其全面质量评价提供参考。

1 仪器与药品、试剂

LC-20AD 高效液相色谱仪；BP121S 电子分析天平（Sartorius）。

橙皮苷对照品（批号161231），二苯乙烯苷对照品（批号160315），五味子醇甲对照品（批号161016），大黄素对照品（批号130526）均购于南京森贝伽生物科技有限公司；精血补片（批号150902、150601、150901、160401、160301、150903、151101、130301、120303、120301，江苏海昇药业有限公司）；乙腈为色谱纯；甲醇等试剂为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A），梯度洗脱（程序为0～10 min，5%～10%B；10～50 min，10%～25%B；50～65min，25%～45%B；65～80min，45%～45%B；80～115 min，45%～80%B）；流速：1 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黄素对照品适量，分别置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解、定容，制得浓度分别为7.879、2.930、0.624、0.194mg·mL-1对照品溶液（Ⅰ）；分别精密量取以上对照品溶液各1 mL，加至5 mL 量瓶中，混匀后用甲醇定容，配制成含橙皮苷1.576mg·mL-1、二苯乙烯苷0.586mg·mL-1、五味子醇甲0.125 mg·mL-1、大黄素0.039 mg·mL-1的混合对照品溶液（Ⅱ），过微孔滤膜，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精血补片粉碎过65 目筛，称取粉末样品0.25 g，置50 mL 具塞锥形瓶中，加入石油醚（60 ℃～90 ℃）20 mL，超声30 min，过滤，弃去滤液，将固体物蒸干，置于具塞锥形瓶中，量取甲醇20 mL，超声30 min，过滤，滤液置水浴锅上70 ℃蒸干，固体物加甲醇溶解，洗涤定容于2 mL 的量瓶中，摇匀，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，过微孔滤膜，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精血补片指纹图谱及含量测定方法建立对10 批样品按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，其混合对照品HPLC 色谱图见图1-A，样品HPLC 图谱见图1-B。根据10 批不同批次样品的液相指纹图谱分析及数据计算，结果对比得出共有峰15 个，10 批次指纹图谱比较见图1-C。

图1 HPLC 色谱图谱

2.4.2 线性关系考察 取“2.2”项下的混合对照品溶液（Ⅱ）50、100、200、500、1 000 μL 置1 mL 量瓶中，用甲醇定容，制成不同浓度的混合标准品，将稀释的混合标准品，按“2.1”项色谱条件检测，以进样量X 为横坐标，以峰面积Y 为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及对照品溶液线性范围等，见表1。

表1 标准曲线

2.4.3 进样精密度试验 取样品（批号160301）按“2.3”项配制供试品溶液，连续进样6 次，每次进样量10μL，按“2.1”色谱条件检测，测定其HPLC 色谱图，以橙皮苷为参考峰，对色谱图中15 个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD 均＜0.4%，共有峰峰面积RSD 均＜1.8%，说明仪器精密度较好。

2.4.4 稳定性试验 取样品（批号160301）按“2.3”项配制供试品溶液，分别于0、4、8、16、24 h 重复进样，每次进样量10 μL，按“2.1”项色谱条件检测，测定其HPLC 色谱图，以橙皮苷为参考峰，对色谱图中的15 个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD 均＜0.8%，共有峰峰面积RSD均＜1.7%，说明供试品溶液在24 h 内稳定性较好。

2.4.5 重复性试验 取样品（批号160301），按“2.3”项制备供试品溶液共6 份，按“2.1”项色谱条件检测，测定其HPLC 色谱图，以橙皮苷为参考峰，对色谱图中的15 个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD 均＜0.7%，共有峰峰面积RSD 均＜2.5%，说明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取样品（批号160301）粉末，精密称取0.125 g 9 份，置于50 mL 具塞锥形瓶中，按“2.3”项制备供试品溶液，在最后固体物中依次加入混合对照品溶液0.57、0.57、0.57、0.71、0.71、0.71、0.86、0.86、0.86 mL 后，再用甲醇定容至2 mL，按“2.1”项色谱条件检测，测定其HPLC 色谱图，分别记录4 种成分的峰面积，根据“2.4.2”的标准曲线计算橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、大黄素的含量和加样回收率，其平均回收率分别为100.01%（RSD 1.27%）、100.49%（RSD 1.53%）、100.32%（RSD 1.41%）、99.67%（RSD 1.42%）。

2.4.7 含量测定 取10 批样品，按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件检测4 种成分的含量，结果见表2。

表2 样品4 种成分含量测定结果（mg·g-1，n=3）

2.4.8 精血补片指纹图谱相似度分析 取10 批样品制成供试品溶液，分别精密量取10 μL，依次注入高效液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。将10 批样品的实验数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版”软件，以中位数法对样品的指纹图谱进行峰点校正，数据匹配分析，生成共有模式图，10 批样品溶液匹配色谱见图1-C，相似度评价结果见表3。

表3 10 批精血补片供试品溶液相似度评价结果

3 讨论

样品处理：比较了水浴加热回流和超声两种方式，结果显示超声分离效果较好；80%甲醇和100%甲醇超声处理，区别不大；而采用石油醚进行脱脂，可去除一些小极性的化学成分。

对供试品溶液进行全波长扫描：分别以234 nm、284 nm 作为检测波长时，色谱图或基线漂移较明显或色谱峰数较少；以254 nm 作为检测波长时，色谱峰数目较多且分离度较好，基线平稳，峰形对称。

对流动相选择时发现：甲醇-水洗脱出的峰分离度不好，且峰形欠佳；乙腈-水洗脱出的峰数目较多、分离度较高，个别峰形不佳，可在水相中加入少量甲酸改变峰形，故选择乙腈-0.1%甲酸水为流动相。

中药指纹图谱技术采用宏观分析方法，能基本反映中药的化学成分及其含量分布状况，可以用来作为鉴别中药真伪优劣的依据。本实验在建立精血补片的HPLC 指纹图谱的基础上，实现了通过相似度分析对不同批次精血补片质量进行评价，可解决本品以单一化学成分作为质量评价标准的局限性问题，也为精血补片的质量控制提供了新的参考。