UPLC-MS/MS同时测定痔血合剂中8种成分含量

孙冰婷，赵 颖，庞 鹏

南京市中医院药学部，南京 210001

痔血合剂是南京市中医院的院内制剂，全方由地榆炭、槐米炭、地黄、栀子炭、仙鹤草、当归炭等11味药材组成，来源于名老中医丁泽民教授的经验方，具有凉血止血、收敛止血之效，临床用于咯血、吐血、肛裂、内痔及便血，疗效显著[1]。目前文献报道[2-8]的中药饮片及中药复方制剂中没食子酸、芦丁、栀子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的含量测定方法大多采用HPLC 法或UPLC 法，且未见同时测定这8 种成分的报道。本文建立了UPLCMS/MS 方法同时检测痔血合剂中上述8 种成分，该方法定量限低至纳克级别，且每个样品的分析仅需2 min，具有灵敏、准确、高效的特点，可为该制剂质量标准的优化提供借鉴。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Agilent 1290 超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；API4000 LC-MS/MS 三重四级杆质谱仪（美国AB Sciex 公司），配有电喷雾化离子源（ESI），Analyst 1.4.2 色谱工作站；CPA225D 电子天平（德国Sartorius 公司）；Legend Micro 17R 冷冻离心机（美国Thermo 公司）。

1.2 药品与试剂

痔血合剂（批号171025、171227、180130），本院药学部制剂；对照品：没食子酸（纯度90.8%，批号110831-201605）、芦丁（批号100080-201610）、栀子苷（纯度97.6%，批号110749-201718）、槲皮苷（纯度90.6%，批号111538-201606）、阿魏酸（纯度99.0%，批号110773-201614）、柚皮苷（纯度93.4%，批号110722-201714）、新橙皮苷（纯度99.2%，批号111857-201703）、黄 芩苷（纯 度93.5%，批 号110715-201619）均购于中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱质谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，1.7 μm）；流动相：甲醇-水（含2 mmol·L-1甲酸铵）（65∶35）；流速：300 μL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。

电喷雾离子化（ESI），负离子检测，多反应监测（MRM）模式；离子源电压：4 000 V；离子源温度：400 ℃。各成分的质谱参数见表1。

表1 8 种成分质谱参数

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液 精密称取没食子酸、芦丁、栀子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷对照品适量，用甲醇分别配制成1.002、1.037、1.014、1.020、0.999、1.008、1.032、1.056 mg·mL-1对照品 储备液。精密吸取各对照品储备液适量，用甲醇稀释成6 个不同浓度的混合对照品系列溶液。

2.2.2 供试品溶液 吸取痔血合剂1 mL，置于100 mL 量瓶中，加甲醇80 mL，超声30 min，放冷后甲醇定容，摇匀。吸取1 mL 该溶液于EP 管中，12000 r·min-1离心10 min 2 次，取上清液，用甲醇稀释10倍，即得供试品溶液。

2.3 专属性考察

在“2.1”色谱及质谱条件下，没食子酸、芦丁、栀子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的保留时间分别为0.89、1.12、1.02、1.23、0.96、1.07、1.09、1.08 min，基线平稳，峰形良好，其它成分对测定无干扰，见图1。

图1 8 种成分的UPLC-MS/MS 色谱图

2.4 线性关系考察

吸取“2.2.1”项下混合对照品系列溶液2 μL 进样分析。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）作线性回归，得标准曲线方程，见表2。8 种成分在各自浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取含8 种成分的低、中、高浓度混合对照品溶液（分别含没食子酸10.00、50.00、200.0 ng·mL-1，芦 丁80.00、400.0、1 600 ng·mL-1，栀子苷20.00、100.0、400.0 ng·mL-1，槲皮苷1.000、5.000、20.00 ng·mL-1，阿魏酸1.000、5.000、20.00 ng·mL-1，柚皮苷80.00、400.0、1600 ng·mL-1，新橙皮苷80.00、400.0、1600 ng·mL-1，黄芩苷20.00、100.0、400.0 ng·mL-1），按“2.1”项下色谱质谱条件进样分析，平行测定3 份，测定色谱峰峰面积并计算精密度。结果表明，低、中、高3 种浓度没食子酸的RSD 分别为1.39%、2.06%、0.29%；芦丁的RSD 分别为1.77%、1.84%、2.30%；栀子苷的RSD 分别为3.39%、0.46%、1.48%；槲皮苷的RSD 分别为0.12%、0.76%、2.47%；阿魏酸的RSD 分别为2.04%、2.47%、2.11%；柚皮苷的RSD 分别为3.09%、4.29%、2.46%；新橙皮苷的RSD 分别为1.39%、3.27%、0.79%；黄芩苷的RSD 分别为4.11%、2.36%、0.37%。仪器精密度良好。

表2 8 种成分的线性关系

2.6 重复性试验

取批号为171025 的痔血合剂样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，平行操作6 份，按“2.1”项色谱质谱条件进样分析，测得没食子酸、芦丁、栀子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的RSD 分别为1.89%、2.24%、1.66%、3.83%、3.04%、2.30%、3.29%、1.85%。表明重复性良好。

2.7 加样回收率试验

吸取批号为171025 的痔血合剂已知含量样品500 μL，分别精密加入没食子酸、芦丁、栀子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的对照品溶液，置于100 mL 量瓶中，加甲醇80 mL，超声30 min，放冷后甲醇定容，摇匀。吸取该溶液1 mL 于EP管中，12 000 r·min-1离心10 min 2 次，取上清液，用甲醇稀释10 倍，按“2.1”项下色谱质谱条件进样测定8 种成分的含量，计算加样收回率，结果见表3。

2.8 稳定性试验

按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于室温下放置0、4、8、12、24h，按“2.1”项色谱质谱条件进样分析，测得没食子酸、芦丁、栀子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷和黄芩苷峰面积的RSD 分别小于2.87%、4.12%、5.11%、1.36%、2.43%、0.60%、7.32%、2.58%（n=3）。表明8 种成分在室温下放置24h 均稳定。

表3 8 种成分的加样回收率

2.9 含量测定

3 批痔血合剂按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱质谱条件进样测定，计算没食子酸、芦丁、栀子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的含量，平行测定3 次，结果见表4。3 批制剂中8 种成分含量基本稳定。

表4 痔血合剂中8 种成分的含量测定结果（μg·mL-1，n=3）

3 讨论

本实验考察了不同色谱柱对分离效果的影响。先后选用Agilent ZOBAX SB C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18色谱柱（2.00 mm×100 mm，3 μm）、Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），发现小粒径Acquity 色谱柱得到的峰形较尖、峰高更高。

对流动相考察时选取乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水（含2 mmol·L-1甲酸铵）等，结果显示，选用乙腈为有机相时，没食子酸、阿魏酸、柚皮苷、黄芩苷峰形不佳；选用甲醇-水（含2 mmol·L-1甲酸铵）为流动相时，8 种成分均峰形较好，灵敏度较高。

对8 种成分的质谱参数进行了优化，结果表明在负离子模式下均响应良好，故以负离子模式检测。