D5、D6优质囊胚移植和冷冻策略研究*

陈清汾，康跃凡，林典梁，杜生荣

福建省妇幼保健院(福建医科大学附属医院)生殖医学中心(福州 350001)

随着囊胚培养和玻璃化冷冻技术的不断完善，选择性单囊胚移植已经日益成为趋势，尤其是冻融周期单囊胚移植，既可保证较高的妊娠率的同时，还能减少多胎妊娠的发生[1-2]。但是当前对冻融周期选择性单囊胚移植还缺乏统一的标准。有学者认为优质的D5囊胚可行单囊胚冷冻复苏和移植[3,6]。那么为减少反复冻融对胚胎造成的损害，必然需要将所有优质D5囊胚施行单胚冷冻。既增加胚胎冷冻保存所需的时间和费用，还会占用大量的冷冻空间。因此D5囊胚的冷冻策略成为了一个亟待解决的问题。另外，文献报道D6囊胚的妊娠率和种植率明显低于D5囊胚[4-5]，优质D6囊胚冷冻和移植策略也是本研究讨论的一个问题。

对象与方法

1 研究对象 回顾性分析2015年1月至2017年10月于福建省妇幼保健院生殖中心实施冻融周期至少一个优质囊胚移植的患者资料。纳入标准：女方取卵年龄<38岁；首次行D5或D6至少一个优质囊胚移植。排除标准：子宫畸形、子宫肌腺症、子宫内膜异位症以及PGD冻融周期患者。根据移植的囊胚数、囊胚等级和囊胚的发育速度分为D5单优质囊胚组(D5-SHBT，822个移植周期)、D5双优质囊胚组(D5-DHBT，503个移植周期)、优和非优D5囊胚组(D5-H & PBT，116个移植周期)、D6单优质囊胚组(D6-SHBT，210个移植周期)、D6双优质囊胚组(D6-DHBT，94个移植周期)、优和非优D6囊胚组(D6-H & PBT，119个移植周期)。

2 研究方法

2.1 囊胚培养及评分：常规行控制性促排卵，经常规体外受精(In vitro fertilization，IVF)或卵泡浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)进行受精。待胚胎发育至第3天时，挑选可用于冷冻或移植的胚胎1～2个，其余正常受精的胚胎置于G2培养液(Vitrolife，瑞典)中继续培养2～3 d，将达到冷冻标准的胚胎进行玻璃化冷冻保存。参照Gardner 评分标准，根据囊胚的扩张程度，内细胞团和滋养细胞层的质量对D5和D6囊胚进行评分。若囊胚在3期以上，且内细胞团或滋养细胞层在B级以上则予以冷冻保存。如果内细胞团/滋养细胞层评分均在B级以上(≥3BB)评为优质囊胚。本研究纳入的冻融移植周期均为至少含有一个优质囊胚的单囊胚或双囊胚移植。

2.2 囊胚冷冻及复苏:所有囊胚均采用玻璃化冷冻及冻融的方法进行，冷冻及冻融的操作按玻璃化冷冻、解冻试剂盒(COOK，澳大利亚)说明书进行。移植当天解冻囊胚，经激光辅助孵化后，置于G2培养液(Vitrolife，瑞典)于COOK培养箱中培养1～2 h，观察囊胚的扩张情况。

2.3 内膜准备与囊胚移植:患者采用人工周期或是自然周期备子宫内膜。在黄体酮注射5～6 d后或排卵5～6 d后进行超声引导下的囊胚移植。胚胎移植术后14 d可验尿或抽血查β-hCG证实是否妊娠，妊娠6～7周，B超检查确定是否临床妊娠。

2.4 临床结局评价指标:临床临床妊娠率(%)=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；种植率(%)=孕囊数/移植囊胚数×100%；流产率(%)=流产周期数/临床妊娠周期数×100%；多胎率(%)=超过1个孕囊的妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；早产率(%)=妊娠28～小于37足周的周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率(%)=分娩胎儿的周期数/移植周期数×100%。

结 果

1 冻融周期D5-SHBT、D5-DHBT和D5-H & PBT妊娠结局比较 D5-SHBT、D5-DHBT和D5-H & PBT三组患者的平均年龄、子宫内膜厚度和子宫内膜准备方式比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。三组流产率之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。而种植率、临床妊娠率、多胎率、早产率和活产率组间比较，差异均具有统计学意义(均P<0.05)：其中D5-DHBT临床妊娠率显著高于D5-SHBT(P<0.014)，D5-H & PBT临床妊娠率与D5-DHBT、D5-SHBT比较差异均无统计学意义(均P>0.014)；D5-SHBT种植率显著高于D5-H & PBT(P<0.014)，其余两组种植率比较差异均无统计学意义(均P>0.014)； D5-DHBT和D5-H & PBT多胎率均显著高于D5-SHBT(均P<0.014)，D5-DHBT和D5-H & PBT多胎率比较差异无统计学意义(P>0.014)；D5-DHBT早产率均显著高于D5-H & PBT和D5-SHBT(均P<0.014)，D5-H & PBT和D5-SHBT早产率比较差异无统计学意义(P>0.014)；D5-DHBT活产率显著高于D5-SHBT(P<0.014)，其余两组活产率比较差异无统计学意义。见表1。

2 冻融周期D6-SHBT、D6-DHBT和D6-H & PBT妊娠结局比较 D6- SHBT、D6-DHBT和D6-H & PBT三组患者平均年龄、子宫内膜厚度和子宫内膜准备方式比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。三组种植率、流产率和早产率之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。三组临床妊娠率、多胎率和活产率组间比较，差异均具有统计学意义(均P<0.05)，其中D6-DHBT和D6-H & PBT临床妊娠率、多胎率及活产率均显著高于D6-SHBT(均P<0.014)，D6-DHBT临床妊娠率、多胎率及活产率和D6-H & PBT比较差异均无统计学意义(均P>0.014)。见表2。

3 D5和D6单、双优质冻融囊胚移植周期的妊娠结局比较 D5-SHBT、D5-DHBT、D6-SHBT和D6-DHBT四组患者平均年龄、子宫内膜厚度和子宫内膜准备方式比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。各组流产率之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而种植率、临床妊娠率、多胎率、早产率和活产率组间比较，差异均具有统计学意义(均P<0.008)。其中D5-DHBT临床妊娠率和活产率均显著高于D6-SHBT和D6-DHBT(均P<0.008)；D5-SHBT临床妊娠率和活产率均显著高于D6-SHBT(均P<0.008)，但与D6-DHBT比较差异无统计学意义(P>0.008)；D5组种植率均显著高于D6组(均P<0.008)；双优质囊胚移植组的多胎率均显著高于单优质囊胚移植组(均P<0.008)，D5-DHBT多胎率显著高于D6-DHBT(P<0.008)；D6-DHBT早产率显著高于D5-SHBT(P<0.008)，D5-DHBT早产率显著高于D6-SHBT(P<0.008)。见表3。

表1 D5-SHBT、D5-DHBT和D5-H & PBT妊娠结局比较

表2 D6-SHBT、D6-DHBT和D6-H & PBT妊娠结局比较

表3 D5和D6单、双优质冻融囊胚移植周期妊娠结局比较

讨 论

辅助生殖技术首要目标是保证健康、足月的单胎妊娠，同时还要减少多胎妊娠的发生。而选择性单囊胚移植已经成为满足IVF目标的重要手段，尤其是冻融周期选择性单囊胚移植，由于其子宫内膜的同步性较好，可获得更高的累计妊娠率和活产率[2]。但是，我国目前对D5和D6囊胚能否行单囊胚移植及其相应的冷冻方案没有相关的指南或规定。鉴于囊胚形态学评分和发育速度皆是影响妊娠成功的独立因素，针对不同评分和发育速度的囊胚其移植和冷冻方案也应有所区别[7,11]。

对于冻融周期D5囊胚移植，多数文献认为移植D5双囊胚的种植显著低于移植D5单囊胚，且移植D5双囊胚的多胎率显著高于移植D5单囊胚，由此建议D5囊胚可行单囊胚移植[3,6]。但上述研究并未对移植D5单优质囊胚和D5双优质囊胚的临床结局作比较，更没有针对移植D5优质和非优质两个囊胚的临床结局的统计结果。廖宏庆等的研究虽然对冻融周期选择性D5单优质囊胚和D5双优质囊胚的妊娠率、种植率和多胎率作了比较，但并未涉及活产率和早产率的研究[8]。

本研究对冻融周期移植一个以上优质D5囊胚患者的临床结局作了比较，结果发现，与D5-DHBT相比，D5-SHBT临床妊娠率和活产率均较低(均P<0.014)，但是其多胎率和早产率也明显降低(均P<0.014)，这与Devine等的报道一致[9]。Devine等还证实D5-SHBT可获得更高的累计妊娠率和活产率[9]。此外，本研究中发现，D5-H & PBT虽获得与D5-DHBT相近的临床妊娠率和活产率(均P>0.014)，并可显著降低早产率(P<0.014)，但是其多胎率依然显著高于D5-SHBT(P<0.014)。因此，D5-SHBT仍是降低多胎妊娠的最有效的方法。

为减少反复冻融对胚胎造成的损害，冻融周期行选择性单囊胚移植必然需要将所有优质D5囊胚施行单胚冷冻。这既增加了冷冻和保存的费用和时间，还使得胚胎存储所需空间成倍增长。因此如何在保证有足够的胚胎用于单囊胚移植的同时，还能减少冷冻的空间是我们需要考虑的问题。值得注意的是D5-H & PBT分析结果给了我们一个启发，D5-H & PBT可获得与D5-DHBT相近的临床妊娠率和活产率(均P>0.014)，还可以一定程度上降低多胎率(P=0.028)，并显著降低早产率(P<0.014)的发生。因此，建议年龄小于38岁患者可冷冻1～2管单个优质D5囊胚用于冻融周期单囊胚移植，其余行优和非优囊胚组合冷冻的方法。若患者移植一至两管优质D5囊胚还未妊娠，之后再施行D5-H & PBT可以在保证较高妊娠率的同时也能在一定程度上减少多胎妊娠和早产的发生，更能减轻患者的经济负担并减少胚胎冷冻所需空间。

另外对于D6囊胚行冻融周期单囊胚移植，国内外的报道仍存在较多的分歧。Tubbing等的研究发现D5囊胚的临床妊娠率和活产率显著高于D6囊胚，移植D5囊胚更易获得成功妊娠[10]。而Kaye等报道玻璃化冷冻解冻的D6囊胚的临床妊娠率和持续妊娠率与D5囊胚不存在统计学差异，对年龄小于35岁的女性同样可行单囊胚移植[12]。另外Yang等[13]的研究也发现优质的D5和D6囊胚可获得相近的妊娠率和种植率，而低质量的D5囊胚的妊娠率显著高于同质量的D6囊胚，并推测D5和D6囊胚妊娠结局的差异主要取决于低质量的囊胚。因此本研究对冻融周期移植D5和D6单、双优质囊胚的妊娠结局作了比较，结果发现，D5-DHBT临床妊娠率、种植率和活产率都明显高于D6-DHBT(均P<0.008)，且D5-SHBT临床妊娠率、种植率和活产率也都明显高于D6-SHBT(均P<0.008)，这与Desai的研究结果是一致的[7,14]。由此推测，囊胚的发育速度是预测妊娠结局的一个重要因子。

虽然D6-DHBT仍维持较高的多胎率，但是已经明显低于D5-DHBT(P<0.008)。考虑到D6-DHBT可获得与D5-SHBT相近的临床妊娠率(P>0.008)，而D6-SHBT的临床妊娠率、活产率并不理想，显著低于D6-DHBT和D6-H & PBT(P<0.014)，因此建议D6囊胚施行双囊胚移植(D6-DHBT或D6-H & PBT)和冷冻，可获得较高的妊娠率，至于如何避免多胎风险还有待进一步的探讨。