皱纹盘鲍腹足及内脏抗氧化活性研究

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(1.威海长青海洋科技股份有限公司,山东威海 264300;2.荣成市海洋与渔业局,山东威海 264300)

抗氧化肽是一类具有抗氧化活性的多肽的总称。由于天然抗氧化肽比人工合成的抗氧化剂更加安全,近年来,关于从海洋动物蛋白质资源中提取抗氧化肽的研究屡屡见诸报端。据报道,海洋生物抗氧化肽具有多种多样的生物学功能,如抗癌、抗肿瘤、抗高血压、抗血栓、降胆固醇、免疫调节、抗氧化等作用[1]。

皱纹盘鲍是中国传统的名贵食材,含有丰富的蛋白质,还含有较多的钙、铁、碘和维生素等营养元素[2]。其中,皱纹盘鲍内脏的体重是鲍鱼的20%～30%[3],所含营养物为水、蛋白质、维生素等。鲍鱼自身有很高的食用与药用价值,可以给鲍鱼产业带来很高的经济效益,关于鲍鱼加工的研究越来越多,而同样具有药用价值的鲍鱼内脏却一直被当做下脚料处理,这成为鲍鱼加工行业的普遍趋势。我国对海洋资源提取抗氧化多肽的研究很多,曾庆祝等[4]研究从扇贝边酶解物中抗氧化肽的性质,发现扇贝边酶解物具有一定的体内抗氧化活性;杨涛等[5]从海参内脏中制备海参多肽,发现海参内脏多肽具有较好的清除自由基的能力;李哲等[6]研究从贻贝中分离纯化抗菌肽,验证了贻贝抗菌肽具有较强的抗菌性。但是还未见同时对比鲍鱼腹足、内脏抗氧化多肽抗氧化性的研究。

随着酶技术的发展,酶法水解在水产品加工及水产品下脚料综合利用中的应用越来越广泛[7]。对于多肽的抗氧化活性的测定方法可以分为两类:体内测定和体外测定。体内实验法虽然更贴近于生物体系,但是实验成本大且复杂繁琐,实验周期长;体外抗氧化活性的测定方法是建立模拟体内的抗氧化反应体系的评价方法,其中评价方法有还原能力、清除羟基自由基的能力、清除DPPH自由基的能力、清除超氧阴离子的能力、半抑制浓度IC50等[8-9]。因此本文选择测定皱纹盘鲍腹足及内脏抗氧化肽酶解液的体外抗氧化活性来评价分析皱纹盘鲍腹足、内脏抗氧化肽的抗氧化活性,为皱纹盘鲍不同部位蛋白质资源的精深加工提供理论支撑,进一步促进皱纹盘鲍养殖业的增效增收。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皱纹盘鲍 威海长青海洋科技股份有限公司;中性蛋白酶(酶活力21×104U/g) 天津诺维信生物技术有限公司;供试菌株:大肠杆菌(Escherichiacoil,菌株编号:BLZX-168) 国家海产贝类工程技术研究中心实验室;0.1 mol/L盐酸标准滴定溶液 天津标准科技有限公司;DPPH标准品 华夏科技有限公司;砷标准储备液、汞标准储备液、铬标准储备液、铅标准储备液、镉标准储备液 国家钢铁材料测试中心;石油醚、铁氰化钾、三氯乙酸(TCA)、氯化铁、水杨酸、无水乙醇、维生素C、盐酸、氢氧化钾、酒石酸钾钠、氢氧化钠、苯酚、硝酸、盐酸羟胺、过硫酸钾、硼氢化钾、甲基异丁酮、氨水、酒石酸铵、吡咯烷二硫代甲酸铵、二乙氨基二硫代甲酸钠、乙酸、高锰酸钾、二苯氨基脲、硫脲 国药集团化学试剂有限公司。

DK-S24型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司;CP114型电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司;AL104型分析天平 上海梅特勒;UV2800SPC型紫外可见分光光度计 苏州江东精密仪器有限公司;DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;PHSJ-3F型pH计 上海雷磁创益仪器仪表有限公司;L535-1型台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;SXT-02索氏提取器 上海洪纪仪器设备有限公司;GZS-1.0型冷冻干燥机 沈阳北冰洋食品工程有限公司;PF51型原子荧光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;TAS-990 AFG型原子吸收分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 皱纹盘鲍腹足、内脏酶解液的制备 皱纹盘鲍腹足及内脏蛋白质的水解酶为中性蛋白酶。从冰箱中取出皱纹盘鲍腹足、内脏打浆处理后的原料并解冻混匀,分别称取5 g原料加蒸馏水配制成500 mL溶液,并按酶制剂产品标注的最适条件进行酶解,充分酶解后在100 ℃条件下加热灭酶,直至冷却至室温后,于离心机中4000 r/min离心10 min,取酶解上清液备用,即腹足多肽酶解液(Peptides Hydrolysate of Gastropods,PHG)、内脏多肽酶解液(Peptides Hydrolysate of Viscera,PHV),下文均用PHG、PHV来表示皱纹盘鲍腹足、内脏多肽酶解液。

1.2.2 PHG、PHV重金属测定方法

1.2.2.1 食品中总砷及无机砷的测定 GB 5009.11-2014。

1.2.2.2 食品中总汞及有机汞的测定 GB 5009.17-2017。

1.2.2.3 食品中铬的测定 GB 5009.123-2014。

1.2.2.4 食品中铅的测定 GB 5009.12-2017。

1.2.2.5 食品中镉的测定 GB 5009.15-2014。

1.2.3 PHG、PHV成分分析方法 酶解液的固化处理:对PHG、PHV进行冷冻干燥处理并细化至粉末状固体。对PHG、PHV进行成分分析的测定时,均采用PHG、PHV固体粉末。

1.2.3.1 多肽含量的测定 参考杨涛等[5]的测定方法。

1.2.3.2 粗脂肪含量的测定 索氏抽提法(GB/T 5009.6-2003)。

1.2.3.3 多糖含量的测定 苯酚硫酸法(GB/T 9695.31-2008)。

1.2.3.4 水分含量的测定 直接干燥法(GB/T9695.15-2008)。

1.2.3.5 灰分含量的测定 灼烧法(GB/T 9695.18-2008)。

1.2.4 PHG、PHV体外抗氧化活性测定方法

1.2.4.1 还原力的测定 分别取PHG、PHV各1.0 mL于洗净的试管中,向其中加入1.0 mL pH为6.6的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液和1.0 mL 1%铁氰化钾K3Fe(CN)6溶液,摇匀后置于50 ℃的水浴锅中加热2 min。结束之后,立即放于冷水或冰浴中制冷,加入1.0 mL 10%三氯乙酸(TCA)溶液,摇匀充分反应之后,3000 r/min离心5 min。取上清液2.0 mL,依次加入2.0 mL的蒸馏水与0.8 mL 0.1%的氯化铁(FeCl3)溶液,混合均匀,静置10 min之后,于700 nm波长处测其吸光值,所测得的吸光度值的大小表征产物的还原能力。维生素C代替样品作为阳性对照,所有反应条件同上。并用蒸馏水作为空白调零[10]。

1.2.4.2 二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)清除率的测定 称取一定量DPPH·,用三氯甲烷配制成2 mol/L溶液,用无水乙醇稀释成0.1 mmol/L DPPH·溶液备用。分别取0.4 mL不同浓度的PHG、PHV,向其中加入0.4 mL DPPH·溶液,充分混匀,作为样品组;取0.4 mL不同浓度的PHG、PHV,向其中加入0.4 mL无水乙醇,充分混匀,作为对照组;取0.4 mL蒸馏水,向其中加入0.4 mL DPPH·,混合均匀,作为空白组,室温下避光放置30 min后,8000 r/min离心10 min。取上清液于517 nm测定吸光值。以维生素C作为阳性对照[11]。按以下公式计算DPPH·清除率。

式中:A为样品组的吸光度值;A1为对照组的吸光度值;A0为空白组的吸光度值。

1.2.4.3 羟基自由基清除率的测定 样品组的反应体系为9 mmol/L FeSO40.2 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.2 mL,不同浓度的PHG、PHV 0.2 mL以及0.1 mol/L PBS(pH6.6)1.2 mL。以等量的0.1 mol/L PBS(pH6.6)代替除PHG、PHV外的反应体系作为对照组;以等量0.1 mol/L PBS(pH6.6)作为空白组;最后加入8.8 mmol/L H2O20.2 mL启动反应,置于37 ℃水浴加热30 min,8000 r/min离心10 min。取其上清液于510 nm波长下比色。以维生素C为阳性对照[12]。按以下公式计算羟基自由基清除率。

羟基自由基清除率(%)=(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100

式中:A样品为样品组的吸光度值;A对照为对照组的吸光度值;A空白为空白组的吸光度值。

1.2.4.4 超氧阴离子自由基清除率的测定 采用邻苯三酚自氧化法[13]。1.0 mL PHG、PHV与9.0 mL 50.0 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2)混合,取出3 mL的混合溶液,向其中加入0.1 mL邻苯三酚溶液(60 mmol/L),在室温下迅速振荡反应4 min,测定320 nm下该混合溶液的吸光度值A1,空白对照为相同条件下1.0 mL去离子水替代PHG、PHV测得的吸光度值A0。按以下公式计算超氧阴离子自由基清除率。

超氧阴离子自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100

式中:A1为PHG、PHV的吸光度值;A0为空白对照的吸光度值。

1.2.4.5 脂质氧化抑制率的测定 脂质氧化抑制率测定采用硫氰酸铵比色法[14],将PHG、PHV溶于2.5 mL磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L,pH7.0)中,倒入到10 mL具塞比色管中,然后加入50 mmol/L 2.5 mL亚油酸(溶于95%乙醇)溶液,混匀之后加入1.25 mL蒸馏水,将上述反应液放置于45 ℃培养箱中,反应48 h后测定亚油酸的氧化程度,取0.1 mL反应液,加0.1 mL 30%的硫氰酸铵溶液,然后加入4.7 mL 75%的乙醇溶液,最后将其加入0.1 mL 0.02 mol/L氯化亚铁(内含3.5%的盐酸)溶液中,充分振荡,反应3 min后,在波长500 nm处测定吸光度值。按以下公式计算脂质氧化抑制率。

式中:A48未和A0未分别代表未加PHG、PHV的空白组在0、48 h的吸光度值;A48和A0分别为加入PHG、PHV后在0、48 h测得的吸光度值。

1.2.4.6 Fe2+螯合率的测定 向反应体系中分别加入2 mL FeSO4溶液(20 mmol/L),2 mL菲咯臻溶液(0.5 mmol/mL)和1 mL 2%的抑制物,空白对照组中加入同体积的蒸馏水来替代抑制物[15]。按以下公式计算Fe2+的螯合率。

式中:A0为空白对照组的吸光度值;An为加入PHG、PHV溶液后的吸光度值。

1.2.5 PHG、PHV对细菌的抑制作用 采用琼脂扩散法测定抑菌圈的大小[16]。将冷冻保存于-80 ℃下的供试菌株:大肠杆菌在LB固体培养基上划线,置于30 ℃下培养24 h。从活化后的平板上挑取单菌落,接种于25 mL的LB液体培养基中,于30 ℃、200 r/min下摇菌24 h。以含1%琼脂的LB培养基为下层培养基,向含0.7%琼脂的LB培养基中接种供试菌株(100 mL培养基中加入1 mL菌株密度为106CFU/mL的供试菌液),摇匀后制成上层培养基,用打孔器在平板上打孔,孔的直径为0.8 cm,每个平板上打三个孔,1个接种10 μL的PHG、PHV(浓度均为6 mg/mL)为实验组,1个接种10 μL无菌水为阴性对照和1个接种10 μL(1 mg/mL链霉素和1 mg/mL卡那霉素的混合液)为阳性对照,在37 ℃恒温下培养24 h,观察测量抑菌圈的大小。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 PHG、PHV的重金属含量分析

PHG、PHV的As、Hg、Cr、Pb、Cd含量的检测结果如表1所示,PHG、PHV的5项重金属指标均符合《食品安全国家标准 食品中污染物限量》GB 2762-2017的限量要求,且PHG的各项重金属含量均低于PHV,说明皱纹盘鲍腹足及内脏酶解液均适合作为食品级抗氧化肽的原料。

表2 PHG、PHV的主要成分含量测定Table 2 Content detection of main components of PHG,PHV

表1 PHG、PHV的重金属含量检测结果(mg/kg)Table 1 Results of determination ofheavy metals in PHG,PHV(mg/kg)

2.2 PHG、PHV的主要成分测定

PHG、PHV的主要成分含量测定结果如表2所示,均以干基计。PHG、PHV的多肽含量分别为81.17%、78.21%,其在四种成分中含量最高,说明PHG、PHV可作为制备抗氧化肽食品的多肽原料。

2.3 PHG、PHV体外抗氧化活性分析

2.3.1 还原力 还原力的强弱是根据多肽样品在700 nm处的吸光度的大小来进行判断的,在700 nm处的吸光值越大,多肽的还原力就越强,且多肽的抗氧化能力也越强。因此,多肽的还原力是指示多肽抗氧化活性的一个重要指标。由图1可知,在0～12 mg/mL范围内,随着多肽浓度的增大,PHG、PHV的还原力越来越强,VC的还原力也越来越强直至稳定,这说明PHG、PHV和VC的还原力和其浓度是有一定量效关系的。尽管PHG、PHV的还原力随着多肽浓度的增加变强,其还原力没有VC强,但也具有一定的抗氧化作用,且在整个反应时期,PHG的还原力始终略高于PHV,当浓度为12 mg/mL时,二者的还原力最高,PHG的还原力达到0.993,PHV的还原力为0.759。根据线性回归方程得出,PHG还原力的AC50值为7.74 mg/mL,PHV还原力的AC50值为7.25 mg/mL,VC还原力的AC50值为0.052 mg/mL。Zhou[17]等在对鲍足肌的研究时发现抗氧化肽的还原力AC50值为15 mg/mL,对比文献研究,本实验中的PHG、PHV具有较强的抗氧化活性。

图1 不同浓度PHG、PHV的还原力Fig.1 Reduction force of PHG,PHV with different concentrations

2.3.2 DPPH·清除率 如图2所示,PHG、PHV的DPPH·清除率随浓度的增大而逐渐升高,但始终低于VC的DPPH·清除率。在0～8 mg/mL的浓度范围内,PHG、PHV的DPPH·清除率的升高速度越来越快,当浓度为8 mg/mL时,PHG的DPPH·清除率为94.35%,PHV的DPPH·清除率为69.94%;在8～12 mg/mL浓度范围内,二者对DPPH·清除率的升高速度变缓,当浓度为12 mg/mL时,PHG的DPPH·清除率为96.67%,PHV的DPPH·清除率为84.17%。PHG对于DPPH·的清除活性IC50值为3.11 mg/mL,PHV对于DPPH·的清除活性IC50为5.79 mg/mL,VC对于DPPH·的清除活性IC50为0.36 mg/mL，可见对DPPH·清除能力为VC>PHG>PHV,但PHG和PHV的清除能力也是较好的。周大勇[17]等采用木瓜蛋白酶水解鲍鱼内脏得到的酶解液,检测的抗氧化肽酶解液对DPPH·清除率的IC50值为4 mg/mL,比本实验的PHV稍高,可能是由于两者使用的酶解原料、工具酶及酶解条件有差异。

图2 不同浓度PHG、PHV的DPPH·清除率Fig.2 DPPH· clearance of PHG,PHV with different concentrations

2.3.3 ·OH清除率 由图3可以看出,在本实验体系浓度范围内,PHG、PHV对·OH均有不同的清除能力,随着反应体系浓度的增大,其清除率也不断增大,PHG的·OH清除率的IC50值为3.70 mg/mL,PHV的·OH清除率IC50值为4.46 mg/mL,VC的IC50值为0.77 mg/mL,三者的·OH清除率呈明显的剂量依赖关系。在0～6 mg/mL浓度范围内,PHG的·OH清除率高于PHV,在8～12 mg/mL范围内,PHV的·OH清除率高于PHG,这可能是由于多肽的抗氧化活性与氨基酸的种类相关[13]。最终PHG、PHV的清除率分别达到72.66%、78.23%,二者对·OH的清除率逐渐稳定。

图3 不同浓度PHG、PHV的·OH清除率Fig.3 ·OH clearance of PHG,PHV with different concentrations

图4 不同浓度PHG、PHV的清除率PHV with different concentrations

2.3.5 脂质氧化抑制率 如图5所示,在整个反应时期PHG、PHV的脂质氧化抑制率均呈现先逐渐升高至稳定的趋势,在浓度增加到8 mg/mL时,PHG、PHV的脂质氧化抑制率开始逐渐趋于稳定,此时,PHG的脂质氧化抑制率为50.85%,PHV的脂质氧化抑制率为66.51%。游丽君[19]曾提出氨基酸中的共轭结构对维持抗氧化性的稳定性起了至关重要的作用,脂质过氧化的过程实质上是亚油酸生成共轭二烯的过程,当共轭二烯的生成量达到一定程度时,脂质氧化的抑制率便逐渐稳定,多肽的抗氧化性逐渐稳定。PHG的脂质氧化抑制率IC50值为7.41 mg/mL,PHV的脂质氧化抑制率IC50值为4.15 mg/mL,VC的脂质氧化抑制率IC50值为0.83 mg/mL,说明PHV对脂质氧化的抑制作用高于PHG。

图5 不同浓度PHG、PHV的脂质氧化抑制率Fig.5 Inhibition rate of lipid oxidation of PHG,PHV with different concentrations

2.3.6 Fe2+螯合率 Fe2+在脂质的氧化过程中会起到催化作用,因此具有螯合金属离子作用的物质可以间接地起到抗氧化作用,螯合能力的强弱也在一定程度上体现了抗氧化性能的强弱[10]。如图6所示,在浓度达到2.0 mg/mL之前,PHG和PHV对Fe2+的螯合率迅速升高,且PHV对Fe2+的螯合率高于PHG;从浓度4.0 mg/mL起,PHG对Fe2+的螯合率始终高于PHV,直至12 mg/mL时,PHV对Fe2+的螯合率趋于稳定,达到85.97%,PHG对Fe2+的螯合率继续升高,甚至高于VC对Fe2+的螯合率,达到94.47%。整个实验过程中,PHG对Fe2+的螯合率IC50值为3.36 mg/mL,PHV对Fe2+的螯合率IC50值为3.58 mg/mL,VC对Fe2+的螯合率IC50值为0.80 mg/mL,这说明PHG、PHV都表现出较高的螯合铁的能力。

图6 不同浓度PHG、PHV的Fe2+螯合率Fig.6 Fe2+ chelation rate of PHG,PHV with different concentrations

2.4 PHG、PHV对细菌的抑制结果分析

PHG、PHV对大肠杆菌的抑制作用如图7和表3所示,PHG、PHV的抑菌圈直径均大于相应的阳性对照抑菌圈直径,说明PHG、PHV对大肠杆菌都有良好的抑制作用。PHV的抑菌圈直径明显大于PHG,抑菌圈直径为11.61 mm,PHG的抑菌直径为8.62 mm,说明PHV的抑菌能力较PHG更高。丁利君等[20]在研究罗非鱼蛋白酶解液螯合物的抑菌效果时提出,酶解液螯合物中肽分子可能和细菌细胞膜受体蛋白结合,改变细胞质膜的通透性,造成膜结构破坏,引起膜内水溶性物质大量渗出,从而导致细菌死亡。本实验的研究对象PHG、PHV为皱纹盘鲍腹足、内脏的酶解液,其抑菌效果正是上述抑菌机理所致。

图7 PHG、PHV的抑菌效果Fig.7 Antimicrobial effect of antioxidant peptidase hydrolysate注:-：为阴性对照蒸馏水;+：为1000 U/mL的链霉素和卡那霉素阳性对照。

抗氧化肽类别抑菌圈阳性对照阴性对照PHG8.628.06-PHV11.619.23-

3 结论