真空包装狮子头货架期预测模型的建立

杨 欢,刘 毅,邵乐乐,戴瑞彤

(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

狮子头是淮扬菜系中的传统菜肴,在扬州“三头宴”中最为著名[1]。传统狮子头通常以猪肉为主料,经过切粒、腌制、成型后熟制而成,属于熟制的肉丸制品,因其具有肥而不腻、软嫩爽口、四季皆宜、加工方式多样等特点,深受消费者喜爱。目前市场上已经出现一些真空包装的狮子头产品,既便携即食,又能够最大程度地保留狮子头原有风味和品质。但狮子头中水分含量较高,为微生物生长繁殖提供了良好条件,不当的贮藏温度极易引起其腐败变质,引发食品安全隐患,危害人体健康[2]。因此,构建不同贮藏温度下狮子头产品的微生物生长预测模型对预判食品货架期、提高食品的安全稳定性具有重要意义。

预测食品微生物学(predictive food microbiology,PFM)用数学方法描述特定条件下食品中微生物的生长规律,通过建立数学模型,不需要进行传统检测就能快速判断微生物的生长情况,并准确预测产品的货架期[3]。1993年Whiting和Buchenan将模型划分为三个等级[4],一级模型为微生物的生长模型,描述微生物数量与时间之间的函数关系,常见的一级模型为线性模型、修正的Gompertz模型、修正的Logistic模型以及Baranyi模型。二级模型为微生物的生长动力学模型,表达的是环境条件对一级模型中参数的影响,其中平方根模型的使用最为广泛。三级模型是在一级和二级模型基础上建立的应用系统。

目前关于微生物预测模型的研究多集中于水产品[5-7]、生鲜肉[8-10]以及少数散装熟肉制品[11-13]等方面,而对于真空包装的中国传统熟肉制品却很少见。对肉制品建立的微生物预测模型大多都是以液体的肉汤培养基作为基质,该方法虽然便于操作,但是液体培养基较为单一,忽略了原料肉成分的复杂性及其对微生物的影响,目前已有较多研究证实由液体培养基中获得的实验数据会高于原料肉中微生物生长的真实情况[14],进而导致预估的保质期与实际偏差较大。也有学者通过向原料肉中接种特定菌株来构建模型,但该方法接种的通常为一株菌株,而导致食品腐败的微生物并不是单一的,各种微生物之间会互相影响,因此以一种微生物为对象构建生长模型并不能很好地体现原料肉中所有微生物的真实生长状况;此外很多研究表明,在不同贮藏温度下,食品中微生物的种类和数目存在差异,随着贮藏温度的改变,肉制品中优势腐败菌的种类和数量也可能会发生变化[15-19]。因此选择单一菌种作为建模对象不具有代表性,无法推算出食品准确的货架期[20]。直接从原料肉中获得微生物数据则可以忽略基质和微生物间相互作用带来的影响,使模型更具可信性和准确性。

本研究直接从狮子头原料中获得实验数据,分别用线性模型、修正的Gompertz模型、修正的Logistic模型以及Baranyi模型对4、10、15、20、25 ℃贮存条件下狮子头中的菌落总数进行一级方程的拟合,采用平方根模型描述温度对微生物生长速率和延滞期的影响,并通过决定系数R2、残差平方和(residual sum of squares,RSS),均方根误差(root mean square error,RMSE)、准确因子(accuracy factor,Af)、偏差因子(bias factor,Bf)、赤池信息量准则(kaike information criterion,AIC)以及贝叶斯信息准则(bayesian information criterion,BIC)对模型进行评价和验证,进而选择最优模型,并以此为基础建立真空包装狮子头的货架期预测模型,以期为提高狮子头食用安全性提供有力支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪后臀尖肉、猪背膘脂肪、鸡蛋、淀粉、调味料(食盐、酱油、料酒、白砂糖、葱姜等) 北京美廉美超市;铝箔袋、无菌拍打袋、一次性无菌培养皿 北京索莱宝科技有限公司;平板计数琼脂 北京奥博星生物技术有限责任公司;氯化钠 北京化工厂。

EF-12型电炸锅 Topkitchen公司;PIB02型电磁炉 上海奔腾电器有限公司;TP300笔式探针温度计 武强县华洋仪表厂;HH-W600数显恒温水浴箱 金坛市科析仪器有限公司;RS-400型真空包装机 北京日上科贸公司;LDZH-100L型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;YP6002型电子天平 上海佑科仪器仪表有限公司;西班牙IUL Masticator均质器(拍打式) 上海川翔生物科技有限公司;移液枪 美国Eppendorf公司;DHP-9082型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;YT-CJ-2ND型超净工作台 北京亚泰科隆仪器技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 狮子头的制作参考侯曼[21]的方法并做适当修改:将猪后臀尖肉与猪背膘脂肪分别搅成肉糜,按照质量比6∶4混合后,加入10%的蛋液、1.5%食盐、2%淀粉、2%酱油、2%料酒、1%葱末、1%姜末和10%的纯净水(以混合后猪肉糜质量为100,w/w),搅拌均匀,取适量肉馅团成60 g左右肉丸,每次将四个肉丸放入180 ℃油锅中炸2 min,待其表面呈金黄色后取出。冷却后取30个炸制后的肉丸置于装有3000 g水的锅(水温85 ℃,含60 g葱段、60 g姜片和30 g酱油)中煮制。待肉丸中心温度为72 ℃时捞出,装入无菌包装袋中真空包装,在85 ℃水浴锅中进行二次杀菌15 min,冷却后分别置于4、10、15、20、25 ℃培养箱中贮藏,在设定的取样点取三袋样品进行实验。

1.2.2 菌落总数测定 菌落总数的测定参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》方法[22]。

1.3 模型的拟合

1.3.1 一级模型的拟合 一级模型仅考虑微生物的生长情况,本文对狮子头贮藏期间菌落总数分别采用线性模型、经验模型中的修正Gompertz模型和修正Logistic模型以及机理模型中Baranyi模型进行拟合。

1.3.1.1 线性模型 线性方程的表达式为[23]:

Nt=N0+μt

式(1)

式中:Nt为t时刻时菌数的对数值,lg(CFU/g);N0为随时间无限减小时的渐进对数值,相当于初始菌落,lg(CFU/g);μ为微生物的生长速率,d-1;t为贮藏时间,d。

1.3.1.2 修正的Gompertz模型 修正的Gompertz模型表达式如下[24-25]:

Nt=N0+(Nmax-N0)

式(2)

式中:Nt为t时刻时菌数的对数值,lg(CFU/g);N0为初始菌落数对数值,lg(CFU/g);Nmax为稳定期时的最大菌落数对数值,lg(CFU/g);μmax为微生物生长的最大比生长速率,d-1;λ为微生物生长的迟滞时间,d-1;t为贮藏时间,d。

1.3.1.3 修正的Logistic模型 修正的Logistic模型表达式为[26-27]:

式(3)

式中:Nt为t时刻时菌数的对数值,lg(CFU/g);N0和Nmax分别为初始菌落数和最大菌落数的对数值,lg(CFU/g);u为当t为M时的最大比生长速率,d-1;M为微生物达到最大比生长速率所需要的时间,d;t为贮藏时间,d。

基于上述参数,由如下公式计算最大比生长速率和迟滞时间:

式(4)

式(5)

式中:μmax为最大比生长速率,d-1;λ为恒温条件下的迟滞时间,d。

1.3.1.4 Baranyi模型 Baranyi方程如下[28]:

Nt=N0+μmax+ln[exp(-μmaxt)+exp(-μmaxλ)-exp(-μmax-μmaxλ)]-ln{1+[exp(μmaxλ-μmaxλ)-exp((-μmaxλ)]/exp(Nmax-N0)}

式(6)

式中,Nt为t时刻菌数的对数值,lg(CFU/g);N0和Nmax分别为初始菌落数和最大菌落数的对数值,lg(CFU/g);μmax为最大比生长速率,d-1;λ为恒温条件下的迟滞时间,d;t为贮藏时间,d。

1.3.2 二级模型的拟合 采用平方根模型描述最大比生长速率和迟滞时间与温度间的线性关系,其公式如下[29]:

式(7)

式(8)

式中:T为贮藏温度, ℃;Tminλ、Tminμ为微生物生长速度为零时的理论最低温度, ℃;bλ、bμ为方程的常数。

1.3.3 模型的评价与验证

1.3.3.1 模型的评价 对模型进行评价是模型建立过程中的关键环节,采用决定系数R2、残差平方和(RSS),均方根误差(RMSE)、赤池信息量准则(AIC)以及贝叶斯信息准则(BIC)综合评估模型的拟合能力,各参数表达式如下[3,27,30]:

RSS=∑(Oi-Pi)2

式(10)

式(11)

式(12)

式(13)

式中:n是观测点的数量;Oi是第i个数据点时的实测值;Pi是第i个数据点时的预测值;m是实测值的平均值;p是模型自变量的个数。

R2越接近于1代表拟合优度越好,通常情况下R2至少为80%才表示拟合的模型可以被接受[31]。RSS、RMSE、AIC和BIC的值越小也代表模型的拟合性较好。

1.3.3.2 模型的验证 使用准确因子(Af)、偏差因子(Bf)对拟合的一级模型进行验证,验证公式如下[32]:

式(14)

式(15)

式中:N预测是通过拟合模型预测的菌落总数,(CFU/g);N实测是在相同时间下实际测得的菌落总数,(CFU/g);n为实验次数。

Bf表示实测值与预测值的偏差程度,当Bf>1表示预测值大于实际值,Bf<1表示模型的预测值低于实际值,其值在0.9～1.05之间时表示模型拟合效果很好,在0.7～0.9和1.06～1.15范围内表示拟合效果可以被接受[26,33]。Af则反映了预测值与实测值的接近程度,其值在1附近时的拟合效果越好,Af越高则表明模型拟合的准确度较低,通常Af在1.1～1.9范围内可以被接受[34]。

1.3.4 货架期预测模型的建立与验证 在最优一级模型的基础上,代入初始菌落数(Nmax)和腐败限量值(Ns),计算菌落总数从初始值增加到腐败限量值所需的时间,建立狮子头的货架期预测模型,公式如下:

式(16)

式中:SL代表狮子头的货架期,d;λ为恒温条件下的迟滞时间,d;N0为初始菌落数对数值,lg(CFU/g);Nmax为不同温度下最大菌落数对数值的平均值,lg(CFU/g);μmax为最大比生长速率,d-1;Ns为达到货架期终点时的菌落总数对数值,lg(CFU/g)。

将预测得到的货架期与实际货架期进行比较,计算相对误差值来验证货架期模型的准确性。

式(17)

1.3.5 数据处理 利用Microsoft Excel 2007软件整理并计算实验数据,不同温度贮藏组实验重复三次,图表中数据为平均值±标准偏差。单因素方差分析采用SPSS 19.0(IBM,USA),P<0.05表示数据差异具有显著性。采用OriginPro 8.5.0软件(OriginLab,Northampton,Massachusetts,USA)拟合微生物生长曲线。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏温度下真空包装狮子头微生物生长曲线

菌落总数的生长曲线通常包含迟滞期、对数期和稳定期,随时间的延长大致呈现“S”型,不同贮藏温度下,菌落总数生长曲线差异明显。如图1所示,贮藏初期狮子头中菌落总数数值较低,可能油炸、煮制和灭菌等工艺杀灭了大部分的微生物。在贮藏过程中,4 ℃条件下的微生物生长速度较为缓慢,前40 d内变化不大,40 d后缓慢上升,在贮藏85 d时,菌落总数达到4.09 lg(CFU/g),超过国标GB2726-2016对熟肉制品的限量值4 lg(CFU/g)[35],在140 d时达到菌落总数的最大值。随着贮藏温度的升高,微生物的生长速度加快。

表1 不同一级模型拟合的相关参数Table 1 The parameters of different primary models

10 ℃条件下,贮藏32 d后菌落总数呈现显著上升(P<0.05)。15、20、25 ℃下微生物生长的迟滞期不明显,菌落总数从贮藏初期即迅速生长。不同贮藏温度下微生物达到稳定期的时间随着贮藏温度的升高而下降,在4 ℃贮藏时菌落总数在120 d后趋于稳定,而10、15、20、25 ℃条件下到达稳定期的时间分别是64、24、16、12 d。狮子头中的最大菌落数随温度的升高而升高,由4 ℃的5.21 lg(CFU/g)升高至25 ℃的7.21 lg(CFU/g),上升了2个对数级。15、20 ℃条件下狮子头中的最大菌落数非常接近,但20 ℃贮藏的样品菌落总数在达到最高点后出现略微下降,说明在该温度下贮藏16 d就已经达到微生物的衰亡期,这与宋志强的试验结果一致[6]。在25 ℃贮藏条件下,菌落总数在第15 d达到最大值,此时狮子头出现涨袋、发粘等现象,并伴有异味产生。综上可知温度对于狮子头中微生物的生长繁殖有明显的影响。

图1 不同温度下菌落总数生长曲线Fig.1 Microbial growth curve at different temperatures

2.2 一级模型的拟合与评价

线性模型、修正的Gompertz模型(mGM)、修正的Logistic模型(mLM)以及Baranyi模型(BM)对不同贮藏温度下真空包装狮子头中菌落总数的生长曲线拟合所得的参数值如表1所示。

由表1可知,随着温度升高,最大比生长速率μmax增大,迟滞期λ变短。这是因为低温抑制了狮子头中微生物的生长。而25 ℃是常见微生物生长较适合的温度,因此在此温度下贮藏初期菌落总数不断上升。此外,温度对微生物体内的酶也会产生影响,进而影响微生物的生长繁殖速率。另有研究表明低温时微生物可能无法正常输送营养物质,而温度升高可以加强微生物的酶促反应,进而缩短迟滞期并提高其生长速率[36]。

对不同一级模型拟合得到的参数值进行比较,线性模型拟合的参数值与其他三个模型具有较大差异。mGM、mLM与BM拟合的初始菌落值和最大比生长速率值非常接近。在4、10 ℃时,mGM与mLM拟合出的迟滞期的比值接近于1,随着温度升高该比值不断变大,20 ℃时其值已经超过2,25 ℃时则已经临近于3。BM拟合得到的迟滞期明显低于mGM和mLM,其中BM拟合25 ℃贮存样品所得的迟滞时间为-0.04 d,但该值不可能为负值,由此表明BM拟合失败。

对使用不同一级模型拟合出的参数进行评价,其结果如表2所示。在三种模型中线性模型的R2值最低,在20 ℃时仅为0.5551,且其RSS、RMSE、AIC和BIC值均较高,表明线性模型不适用于狮子头贮藏期间菌落总数的拟合。而mGM与mLM中这四个参数的数值相差不大,其R2值均在97%以上,表明两种模型都可以较好地拟合不同温度下微生物的生长情况,需进一步比较其二级模型的拟合效果确定最优模型。

表2 不同一级模型拟合结果评价参数的比较Table 2 Comparison of the evaluation parameters of different primary models

表3 不同二级模型方程及其拟合的相关参数Table 3 The equations and parameters of different secondary models

2.3 二级模型的拟合与评价

二级模型描述了一级模型拟合出的参数与环境条件(温度、pH、水分活度等)之间的函数关系。本文在一级模型的基础上,使用平方根模型将由mGM和mLM拟合得到的最大比生长速率和迟滞期分别与温度进行线性拟合,观察温度对两个参数的影响,并比较其拟合效果,选出最优模型。拟合效果图见图2和图3。

图2 修正的Gompertz模型下温度与最大比生长速率(A)和迟滞期(B)的关系Fig.2 Relationship between temperature and specific growth rate(A)and lag phase(B)derived from modified Gompertz model

图3 修正的Logistic模型下温度与最大比生长速率(A)和迟滞期(B)的关系Fig.3 Relationship between temperature and specific growth rate(A)and lag phase(B)derived from modified Logistic model

平方根模型的方程式及评价参数如表3所示。

表3为分别以mGM和mLM为基础采用平方根模型拟合所得方程的相关参数。在由mLM中的参数拟合得到的二级模型中,温度与最大比生长速率拟合得到的线性方程的R2达0.9562,但温度与迟滞期的线性关系较差,其R2仅为0.8642,表明mLM拟合所得方程效果不是很好。在由采用mGM拟合参数得到的二级模型中,两个模型的R2分别为0.9193和0.9296,均大于0.9,且其RSS、RMSE、AIC和BIC值都相对较低。考虑到上述拟合模型R2的差异,并兼顾到RSS、RMSE、AIC和BIC等评价指标,进行平方根模型拟合时采用来自mGM的参数可以更准确地描述温度对生长速率和迟滞期的影响。

由上述分析可知,在四种模型中,mGM拟合效果最好,因此本研究选择mGM对狮子头中的菌落总数进行拟合,并以此为基础建立货架期预测模型。微生物预测模型中,Gompertz模型和Logistic模型同属经验模型,在熟腌肉[26]、冷却猪肉[37]、凉皮[38]和对虾[39]的微生物预测研究中,Gompertz模型均表现出了较好的拟合效果,与本实验结果一致。但目前也有研究表明经验模型虽然可以对微生物生长数据进行较好地拟合,但缺乏生物学基础,较难解释拟合得到参数的生物学意义。Baranyi模型为机理模型,是了解微生物生长规律后基于细胞分裂的生长规律而建立,模型具有生物学意义。张莉等[24]、陈睿等[27]研究认为Baranyi模型拟合准确度最高,与本研究结果出现差异的原因可能是不同的数学模型适合的生物学特性并不相同,模型中的变量在微生物生长后期会失去其生物学意义,因此选择的描述性模型越简单越适合[40],而Baranyi模型在经验模型的基础上增添了线性函数,可能与真空包装狮子头中微生物的实际生长曲线不相符;此外微生物种类、食品基质和包装方式的不同也会对模型的拟合效果产生影响。

2.4 模型的验证

为了评价模型的可靠性,使用偏差因子Bf和准确因子Af对拟合的一级模型进行验证,结果如表4所示。5种温度下偏差因子的范围为0.8165～1.0684,准确因子在1.1228～1.4175之间,均属于可接受范畴,表示模型拟合的准确度较高,通过mGM获得的菌落总数数据具有可信度,该模型可用于货架期预测模型的建立。

表4 细菌总数预测值的偏差度与准确度Table 4 Bf and Af on predicted value of total bacterial count

2.5 货架期预测模型的拟合与验证

真空包装狮子头货架期终点时微生物的腐败限量值Ns采用国标GB 2726-2016中规定的限量值104CFU/g。最大菌落数Nmax取不同温度下菌落数的平均值6.22 lg(CFU/g),由式(16)得到真空包装狮子头的货架期预测模型为下式:

式(18)

为验证该货架期预测模型的准确性,采用不同批次的狮子头进行模型验证。由表5可知,贮藏在4、10、15、20、25 ℃的真空包装狮子头的货架期的预测值分别为80.79、45.22、10.96、4.96、4.01 d,预测值与实测值相对误差值的绝对值均在10%以内,表明拟合的货架期模型可以有效的对贮藏在4～25 ℃的真空包装狮子头进行预测。

表5 不同贮藏温度条件下货架期的实测值和预测值Table 5 Predicted and observed shelf-life stored at different temperatures

3 结论

本文以不同贮藏温度下的真空包装狮子头为研究对象,测定4～25 ℃条件下微生物的生长情况,分别用线性模型、修正的Gompertz模型、修正的Logistic模型以及Baranyi模型对菌落总数进行一级模型的拟合,并在此基础上用平方根模型构建二级模型。结果表明,随着温度升高,微生物的繁殖速率不断上升,迟滞期不断缩短。对比模型拟合的评价参数,修正的Gompertz模型表现出最高的拟合优度。用准确因子(Af)及偏差因子(Bf)对模型进行验证,表明建立的微生物预测模型具有可信性,可以快速准确地预测狮子头中微生物的生长态势。进一步建立狮子头的货架期预测模型,预测值与实测值的相对误差均在10%以内,表明该模型可以很好地预测4～25 ℃贮藏真空包装狮子头的货架期。