气相色谱法测定泊马度胺中5种残留溶剂

徐茂红1,戴根来,周美云

(1.皖西卫生职业学院,安徽六安 237005;2.合肥久诺医药科技有限公司,安徽合肥 230088)

泊马度胺(Pomalidomide),化学名为3-氨基-N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)邻苯二甲酰亚胺,是美国Celgene公司研发的第三代免疫调节剂,于2013年2月首次在美国获准上市[1]。其具有抗多发性骨髓瘤肿瘤细胞的关键功能,适用于既往接受过至少两种药物(包括来那度胺、硼替佐米)且最近治疗进行中或治疗完成60 d内疾病进展的多发性骨髓瘤患者[2]。泊马度胺的生产工艺复杂,生产过程使用多种有机溶剂,如甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六环等[3-6]。根据人用药品注册技术规范国际协调会(ICH)要求,必须对残留溶剂进行检测,以保障用药安全。经文献调研,关于泊马度胺原料中残留溶剂的测定方法虽有报道,但文献中研究的残留溶剂种类较少,且未包含本研究中的溶剂,各国药典也均未收载。在泊马度胺合成过程中使用的有机溶剂多达十余种,采用同一种方法检测所有溶剂很难实现。本文在预试验的基础上,采用气相色谱法一次性测定甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六环、乙酸5种溶剂残留量,依据《中华人民共和国药典》(2015年版)对原料药中残留溶剂测定的要求[7],进行了系统的方法学验证,以期为泊马度胺的生产工艺改进和质量标准制定提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

泊马度胺样品(3批批号分别为130301、130302、130303) 合肥久诺医药科技有限公司;二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六环、乙酸 均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。

HP1890气相色谱仪 惠普上海分析仪器有限公司;METTLER AB135-S 十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent DB-624(30 m×0.53 mm×3.0 μm),FID 检测器,以氮气为载气,流速4.0 mL·min-1,程序升温,起始温度为70 ℃,维持5 min,以每分钟10 ℃的速率升温至220 ℃,220 ℃维持10 min;进样口温度为180 ℃;检测器温度为250 ℃,进样量1 μL。氮气流量:30 mL·min-1,氢气流量:30 mL·min-1,空气流量:300 mL·min-1[8]。

1.2.2 溶液制备 单标溶液的制备:取甲醇300 mg、乙醇500 mg、乙酸乙酯500 mg、二氧六环38 mg、乙酸500 mg,精密称定,分别置于不同含有适量二甲基亚砜的100 mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度,摇匀,作为单标贮备液。精密量取单标贮备液5 mL,置50 mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度,摇匀,制成每1 mL约含甲醇300 μg、乙醇500 μg、乙酸乙酯500 μg、二氧六环38 μg、乙酸500 μg的溶液,作为单标溶液。

混合标准品溶液的制备:取甲醇300 mg、乙醇500 mg、乙酸乙酯500 mg、二氧六环38 mg、乙酸500 mg,精密称定,置于同一含有适量二甲基亚砜的100 mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度,摇匀,作为混合对照品贮备液。精密量取混合对照品贮备液5 mL,置于50 mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度,摇匀,制成每1 mL约含甲醇300 μg、乙醇500 μg、乙酸乙酯500 μg、二氧六环38 μg、乙酸500 μg的混合溶液,作为混合对照品溶液。

供试品溶液的制备:取泊马度胺约1.0 g,精密称定,置于10 mL量瓶中,加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 专属性考察

分别取“1.2.2”项下单标溶液、混合标准品溶液、供试品溶液与空白溶剂(二甲基亚砜),照“1.2.1”项下的色谱条件进行检测,记录色谱图,确定各单标保留时间,计算各组分峰的分离度(R,R=2(tR2-tR1)/(W1+W2))。2015版《中国药典》(四部)规定,GC法检测理论塔板数大于5000、分离度大于1.5满足要求。结果显示:空白溶剂及样品无干扰,各组分峰理论塔板数和分离度均符合2015年版《中国药典》要求,最小分离度R=4.000>1.5,各峰的理论塔板数分别为16919、13323、13901、16701、74032;各峰分离度分别为4.000、13.647、12.710、23.899。空白试剂、供试品溶液、混合标准溶液的GC图谱见图1,保留时间及分离度结果见表1。

图1 空白溶剂(A)、供试品溶液(B)和混合溶液(C)的GC图谱Fig.1 GC chromatograms of blank solution(A),pomalidomide bulks drug(B)and mixed solution(C)

表1 专属性测定结果Table 1 The results of specificity test

表2 残留溶剂定量限、检测限及线性方程研究结果Table 2 The limits of quantitation,the limits of detection and the linear equation results of residual solvents

2.2 定量限、检测限以及线性关系考察

取“1.2.2”项下溶液,逐级稀释,按“1.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图,以信噪比S/N=10测得残留溶剂定量限;以信噪比S/N=3测得残留溶剂检测限。

用二甲基亚砜将“1.2.2”项下对照品贮备液分别稀释成浓度为甲醇76.28～610.20 μg·mL-1,乙醇126.38～1011.00 μg·mL-1,乙酸乙酯127.53～1020.20 μg·mL-1,二氧六环10.30～82.40 μg·mL-1,乙酸126.5～1012.40 μg·mL-1的系列标准溶液。分别取配制好的系列标准溶液1 μL,按“1.2.1”项色谱条件分别进样,进行测定。分别以甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六环与乙酸峰面积(A)为纵坐标,质量浓度(C,μg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线,结果甲醇在76.28～610.20 μg·mL-1、乙醇在126.38～1011.00 μg·mL-1、乙酸乙酯在127.53～1020.20 μg·mL-1、二氧六环在10.30～82.40 μg·mL-1、乙酸在126.5～1012.40 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好,相关系数均不小于0.995。结果见表2。

2.3 精密度试验

取“1.2.2”项下混合对照品溶液,连续进样6针,记录色谱图及峰面积,结果见表3。

由表3可知,甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六环、乙酸峰面积的RSD均小于10.0%,表明该方法精密度良好。

2.4 重复性实验

取同批次泊马度胺6份,按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.2.1”项下色谱条件方法进样,记录色谱图并计算RSD,结果见表4。

表4 重复性试验结果Table 4 Repeatability test results

由表4可知,甲醇、乙醇残留少量,RSD小于10.0%,乙酸乙酯、二氧六环、乙酸均未检出,说明该方法重复性良好。

2.5 回收率实验

取“2.4项”下的泊马度胺样品9份,每份约1.0 g,精密称定,置10 mL量瓶中,分别精密加入混合对照品贮备液1、2、3 mL(每个浓度各3份),加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度为50%、100%、150%的加样供试品溶液。按“1.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图,按外标法计算含量,并计算回收率,结果见表5～表9。

表5 甲醇回收率试验结果Table 5 Methanol recovery test results

表6 乙醇回收率测定结果Table 6 Ethanol recovery test results

表7 乙酸乙酯回收率测定结果Table 7 Ethyl acetate recovery test results

综合表5～表9,甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六环、乙酸在50%～150%浓度范围内,平均回收率分别为100.9%、97.95%、100.0%、98.79%、98.90%,平均回收率介于97.0%～110.0%之间,说明本方法回收率良好。

2.6 耐用性

按“1.2.1”项下色谱条件,适当调整分析条件,取“1.2.2”项下混合对照品溶液进样,考察分离度变化情况,评估测试结果受分析条件的变化影响程度,测定结果见表10。

表10 耐用性试验结果Table 10 The results of durability test for GC

结果表明仪器分析条件适当变动,各色谱峰之间相邻峰之间最小的分离度均远大于1.5的要求,表明本法对色谱峰之间的分离满足《中国药典》2015年版的要求,故仪器的起始柱温与载气流速出现微小的偏差对试验的检测结果无影响。

表8 二氧六环回收率测定结果Table 8 Two oxygen and six rings recovery test results

表9 乙酸回收率测定结果Table 9 Acetic acid recovery test results

2.7 样品测定

取中试三批泊马度胺样品,按“1.2.2”项下供试品溶液与对照品溶液制备方法制备供试品溶液与对照品溶液,按“1.2.1”项下色谱条件进样,记录色谱图,测定峰面积,外标法计算。分析测定结果见表11。

表11 泊马度胺原料残留溶剂测定结果(%)Table 11 The determination results of residual solvents in pomalidomide

根据《中国药典》2015年版四部附录0861残留溶剂的限度规定,泊马度胺质量标准中规定残留溶剂甲醇不得超过0.3%、乙醇不得超过0.5%、乙酸乙酯不得超过0.5%、二氧六环不得超过0.038%、乙酸不得超过0.5%。结果表明,中试三批泊马度胺此5种溶剂残留均符合泊马度胺原料药质量标准以及《中国药典》2015年版的规定。

3 结论

泊马度胺中残留溶剂乙酸、甲醇、乙醇与二氧六环、乙酸乙酯极性差别较大,在分离过程中选用极性过大或过小的色谱柱都不能实现较好的分离。经多次尝试并结合文献资料[9],本研究选用中等极性的DB-624色谱柱达到较好的分离效果。

不同沸点的溶剂分离快慢不同,低沸点的先分离,高沸点的后分离。甲醇沸点64.7 ℃,乙醇与乙酸乙酯沸点接近,二氧六环与乙酸沸点较高,最先分离出的是甲醇,最后分离出的是乙酸。经多次预试验设置起始温度为70 ℃,不同时间段测定对分离度影响较小,分离效果较好。

在预试的基础上对分析方法进行专属性、检测限、定量限、线性和范围、精密度、准确度及耐用性等考察验证,结果在专属性试验中各溶剂能有效地分离(分离度大于1.5)、互不干扰,空白溶剂对检测溶剂均无影响;检测限与定量限均远低于检测时的样品溶剂限度;线性关系的相关系数均大于0.995;仪器与方法精密度良好,RSD均小于10.0%;各溶剂的回收率均在90%～110%之间,符合2015版《中国药典》规定在80%～120%之间的要求,表明准确度良好;另适当改变起始柱温与载气流速,分离度均达到要求。本方法简单准确、灵敏度高、专属性强,能满足2015年版《中国药典》对溶剂残留检测的实验要求。

经过对三批中试样品的检测,此5种残留溶剂达到2015年版《中国药典》的限度要求,故本方法适于泊马度胺合成过程中有机溶剂甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六环与乙酸残留量的检测,可作为泊马度胺质量控制的技术参考。