SPE结合超高效液相色谱-质谱/质谱仪测定鸡蛋中的万古霉素和去甲万古霉素残留量

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(1.天津中医药大学,天津 301617;2.天津嘉氏堂科技有限公司,天津 300193;3.长春海关(原吉林检验检疫局),吉林长春 130012)

万古霉素和去甲万古霉素均属于三环糖肽类抗生素[1],含有多个氨基酸和碱性的伯氨基团,呈弱碱性[2]。万古霉素和去甲万古霉素是革兰氏阳性球菌的天敌,对绝大多数革兰阳性菌有很好的体外抗菌活性[3],在临床上通常被用作经β-内酰胺类抗生素或其它抗菌药物治疗失败后最后才使用的药物,即用于治疗对其他抗生素不敏感的革兰氏阳性菌所引起的严重致命性感染,故常被认为是“最后一线”药物[4]。

随着动物性食品需求的急剧增长,抗生素类药物的不合理使用、滥用以及不遵守休药期等多种原因所导致的食品安全问题越来越多。研究表明,长期摄入低剂量万古霉素类药物残留的产品,会导致药物在人体内缓慢蓄积,从而引起器官功能紊乱,影响公众健康[5]。因此,动物源食品中万古毒素类药物残留的控制也越来越受到关注。万古毒素被农业部第560号公告规定为禁用兽药[6],也被列入卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第1～5批汇总)》[7]。

抗生素广泛用于养殖业,具有促进其生长、抗菌和抗虫害等方面作用,在鸡肉和鸡蛋调查研究中均有发现四环素类、磺胺等抗生素,严重影响人体健康和进出口贸易[8-9]。目前万古霉素和去甲万古霉素的测定对象主要集中在血液[10]、脑脊液[11]研究上,其他基质较多的是动物源食品[12]、猪肉[13-14]、鱼[15]、虾[16]、饲料[17]、乳制品[18]等,鸡蛋中的研究未见报道。鸡蛋属于动物源食品,基质比较复杂,蛋白质、脂肪等含量较高,基质效应严重,需要进一步净化。动物源食品常用的净化方法有固相萃取技术(SPE)、基质固相分散提取技术(MSDP)和凝胶渗透色谱法(GPC)等[19]。SPE操作简便、快速,对痕量分析具有一定优势。

因此,本文采用SPE净化方式对鸡蛋基质进行净化,结合超高效液相色谱-质谱/质谱仪(UPLC-/MS/MS)测定鸡蛋中万古霉素和去甲万古霉素残留量,以期为鸡蛋中万古霉素和去甲万古霉素的质量控制提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

API4500超高效液相色谱-质谱/质谱仪 美国AB公司;Milli Q型超纯水器 美国Millipore公司;Allegra X-22R型冷冻离心机 美国Beckman公司;Vortex-Genie 2型涡旋混匀器 美国Scientific Industries公司;OA-SYS型氮吹仪 美国Organomation公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 分别精密称取适量万古霉素和去甲万古霉素,加甲醇溶解,并定容于25 mL容量瓶中,作为万古霉素和去甲万古霉素标准储备液。精密移取适量万古霉素和去甲万古霉素标准储备液于25 mL容量瓶中,加甲醇定容,稀释为5 mg/L的混合标准中间液,分装于进样小瓶中备用。用0.1%甲酸水∶乙腈溶液=95∶5 (V/V)将混合标准中间液稀释成5、10、20、50、100 μg/L混合标准工作溶液,现配现用。

1.2.2 样品提取与净化 称取约5 g鸡蛋液(精确至0.01 g)于离心管中,加入20 mL 0.1%甲酸水,涡旋混合2 min后以15000 r/min离心10 min,取出5 mL上清液加入Strata-X-C固相萃取柱(使用前用3 mL 2%甲酸甲醇和6 mL 2%甲酸溶液活化),分别用3 mL水和3 mL甲醇以小于1 mL/min的速度淋洗,弃去,用3 mL10%氨水-甲醇溶液以小于1 mL/min的流速洗脱于氮吹管中,于40 ℃下氮吹至近干,用1 mL 0.1%甲酸水∶乙腈溶液=95∶5 (V/V)溶解,过0.22 μm滤膜,供超高液相色谱-质谱/质谱仪测定。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 液相色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax SB C18(2.1 mm×150 mm,3.5 μm);柱温:30 ℃;流速0.20 mL/min;进样体积:20.0 μL;流动相A为 0.1%甲酸水溶液和B为乙腈。采用梯度洗脱方式:0～5.00 min,95% A～80% A;5.00～7.00 min,80% A～5% A;7.00～9.00 min,5% A;9.00～9.01 min,5% A～95% A。

1.2.3.2 质谱条件 离子源:电喷雾电离(ESI);扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM);离子源温度(TEM):550 ℃;电喷雾电压:5500 V;使用气体:氮气,纯度≥99.99%;气帘气(CUR):206.85 kPa;雾化气(GS1):206.85 kPa;辅助气(GS2):206.85 kPa;碰撞气(CAD):41.37 kPa。母离子、子离子、去簇电压和碰撞能量见表1。

1.3 数据处理

利用Analyst 1.6.2数据处理软件(美国AB公司)处理数据,以万古霉素或去甲万古霉素的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,采用外标曲线法进行回归分析。按照标准曲线计算对鸡蛋液中万古霉素和去甲万古霉素的含量,计算公式如下。

内部控制对于医院的意义更多的是为了能够落实控制目标，通过一系列的内部控制流程将经济活动的风险进行遏制。而且医院作为市场经济中特殊的组织，内部控制的主要目的就是为了提升医疗质量，内部控制将会计信息质量进行提升，为资产安全提供保障。从而确保医院的各项业务能够在遵循法律法规的前提下进行落实，综述就是医院的内部控制是否具有高效的运营直接关系到医院运营管理好坏。

表1 万古霉素和去甲万古霉素的质谱参数Table 1 Mass spectra parameters of vancomycin and norvancomycin

注:*为定量离子。

式中,Xi为鸡蛋液中万古霉素或去甲万古霉素的含量,μg/kg;ci为从标准曲线得到鸡蛋液中万古霉素或去甲万古霉素的浓度,ng/mL;V为鸡蛋液最终定容体积,mL;m为最终鸡蛋液代表的质量,g。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择 万古霉素、去甲万古霉素为水溶性,微溶于甲醇,几乎不溶于乙醇或丙酮,在pH3～5的酸性环境中稳定。以0.2%三氯乙酸溶液、0.1%甲酸水和0.1%甲酸水溶液∶乙腈=5∶5(V/V)[18]为提取溶剂,向5 g鸡蛋液中加入100 μL 5 mg/L的万古霉素和去甲万古霉素混合标准中间液,按照1.2.2项下,取5 mL上清液加入预活化的Strata-X-C固相萃取柱。图1为不同提取溶剂的回收率结果。由图1可知,以0.2%三氯乙酸溶液为提取溶剂时,万古霉素和去甲万古霉素平均回收率较低,可能是因为三氯乙酸酸性较强,影响了Strata-X-C固相萃取柱的上柱效果。以0.1%甲酸水和0.1%甲酸水溶液∶乙腈=5∶5 (V/V)为提取溶剂时,万古霉素和去甲万古霉素平均回收率均大于90%,符合GB/T 27404-2008附录中回收率在60%～120%之间的要求。因此,从环保和经济角度来考虑,最终选定0.1%甲酸水为提取溶剂。

图1 万古霉素和去甲万古霉素在不同提取溶剂下的回收率Fig.1 Recovery rate of vancomycin and norvancomycin with different extraction solvents

2.1.2 净化方法的选择 以0.1%甲酸水为提取溶液,向5 g鸡蛋液中加入100 μL 5 mg/L的万古霉素和去甲万古霉素混合标准中间液,按1.2.2项下,取5 mL上清液加入预活化的PCX[16]、MCX、Strata-X-C[12]、SCX、MCT阳离子交换柱和HLB固相萃取柱。由图2可知,使用Strata-X-C固相萃取柱时,万古霉素和去甲万古霉平均回收率均大于90%,而PCX、MCX、SCX、MCT阳离子交换柱和HLB固相萃取柱的平均回收率均低于90%。分析原因可能是其填料比较致密,离子交换效率较高,回收率较好。因此最终选定Strata-X-C固相萃取柱。

图2 万古霉素和去甲万古霉素在不同固相萃取柱下的回收率Fig.2 Recovery rate of vancomycin and norvancomycin with different solid phase extraction columns

2.1.3 Strata-X-C固相萃取柱洗脱液体积的选择 本方法对Strata-X-C固相萃取柱进行了淋洗曲线试验。以0.1%甲酸水为提取溶液,向5 g鸡蛋液中加入100 μL 5 mg/L的万古霉素和去甲万古霉素混合标准中间液,按1.2.2项下条件通过Strata-X-C固相萃取柱,收集每1 mL洗脱液于单个试管中,共收集8 mL,并分别测定各段洗脱液中万古霉素和去甲万古霉素的含量,以确定Strata-X-C固相萃取柱净化的洗脱收集体积。由图3可知,3 mL洗脱液时万古霉素和去甲万古霉素回收率基本趋于稳定。因此,本方法确定收集3 mL洗脱液可以将万古霉素和去甲万古霉素全部洗脱下来。

图3 10%醇氨水-甲醇洗脱的淋洗曲线Fig.3 Leaching curve eluted of 10% alcohol ammonia-methanol solution

2.2 色谱质谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择 本方法考查了不同色谱柱Agilent Zorbax SB C18(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)、Aglient XDB C18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm);Waters Xbridge C18柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)的影响,结果如图4所示。由图4可知,三种色谱柱均可以得到较好的峰形,Aglient XDB C18峰形稍微差一些,分离度和灵敏度也稍差。但总体来说,Waters Xbridge C18柱和Agilent Zorbax SB C18柱均可以使万古霉素和去甲万古霉素得到基线分离,但Agilent Zorbax SB C18灵敏度较高,故选择Agilent Zorbax SB C18作为色谱柱。

图4 万古霉素和去甲万古霉素不同色谱柱的色谱图Fig.3 Chromatogram of different columns of vancomycin and norvancomycin注:A:Agilent Zorbax SB C18色谱柱;B:Aglient XDB C18色谱柱;C:Waters Xbridge C18色谱柱;1:去甲万古霉素;2:万古霉素。

2.2.2 流动相的优化 在流动相中加入适量甲酸,可以在万古霉素、去甲万古霉素离子化过程中提供质子,提高其离子化效率,从而增加其响应强度,但甲酸含量太高也会抑制其离子化,从而降低响应强度。本方法尝试水相中添加乙酸铵,但万古霉素和去甲万古霉素均不出峰,表明乙酸铵对电离产生严重的抑制作用。因此,本方法采用0.1%甲酸水溶液作为水相,有机相考查了甲醇和乙腈,结果如图5所示。由图5可知,选用乙腈时万古霉素、去甲万古霉素分离度更高,峰形对称性更好,因此最终选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相体系。

图5 万古霉素和去甲万古霉素不同有机相的色谱图Fig.5 Chromatogram of different organic phases of vancomycin and norvancomycin注:A:甲醇;B:乙腈;1:去甲万古霉素;2:万古霉素。

2.2.3 质谱条件的优化 一般质谱条件优化采用1.0 μg/mL的标准溶液通过蠕动泵直接进质谱进行分析。但本方法尝试用1.0 μg/mL的万古霉素和去甲万古霉素混合标准溶液直接进样,在正离子模式下进行母离子全扫描,发现725.0和718.2的分子离子峰,但灵敏度很低,以至于无法进行子离子扫描。于是,尝试用更大浓度的混合标准溶液进行直接进样,直到标准溶液浓度为20.0 μg/mL时,母离子全扫描和子离子扫描时峰比较明显。万古霉素和去甲万古霉素属多肽类抗生素,是由氨基酸缩合而成的肽类物质,分子量分别为1449.2、1434.2,容易形成[M+2H]2+分子离子。由图6可知,母离子全扫描时,m/z 725.3、718.2丰度较大,未发现[M+H]+分子离子峰。因此,选择m/z 725.3、718.2分别作为万古霉素和去甲万古霉素的母离子。通过碎片离子扫描(Product Ion MS2)模式对万古霉素施加不同碰撞能量进行扫描,由图7可知,万古霉素母离子m/z 725.3 产生有显著丰度的m/z 144.1和m/z 1306.0子离子,将m/z 141.1作为定量离子。由图8可知,去甲万古霉素母离子m/z 718.2产生有显著丰度的m/z 144.0和m/z 1292.3子离子,将m/z 144.0作为定量离子。最后以MRM模式优化去簇电压、碰撞能量等质谱参数。

图7 万古霉素的碎片离子扫描谱图Fig.7 Fragment ion scanning spectra of vancomycin

图8 去甲万古霉素的碎片离子扫描谱图Fig.8 Fragment ion scaning spectra of norvancomycin

2.3 方法学考察

2.3.1 基质效应 高效液相色谱-质谱/质谱分析中,离子化是重要的一步。离子化过程中,常因为杂质的干扰而产生基质效应,会干扰目标化合物的离子化。称取两份阴性样品,以0.1%甲酸水为提取溶液,一份添加50.0 μg/kg万古霉素、去甲万古霉素混合标准溶液,按照1.2.2项下方法,Strata-X-C固相萃取柱净化,接取3 mL洗脱液。由图9可知,本方法经净化后,基本无基质效应,因此用标准溶液工作曲线即可进行校正,减轻了检测人员的工作量,节省试剂和材料。

2.3.2 线性范围、检出限、定量限 按1.2.3项下色谱和质谱条件测定5、10、20、50、100 μg/L标准工作溶液,以质量浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得到相应的线性回归方程和线性相关系数。万古霉素和去甲万古霉素在5.0～100.0 μg/L范围内具有良好的线性关系,线性方程分别为Y=2270X+3270和Y=3270X+52.6,线性相关系数(r)分别为0.9995和0.9994。

向阴性样品中加入适量万古霉素和去甲万古霉素标准品,以0.1%甲酸水为提取溶液,按照1.2.2项下方法,Strata-X-C固相萃取柱净化,接取3 mL洗脱液,在按1.2.3项下色谱和质谱条件测定。以信噪比S/N=3计算万古霉素和去甲万古霉素的检出限均为2.0 μg/kg,以信噪比S/N=10计算定量限均为5.0 μg/kg。

2.3.3 回收率与精密度 回收率采用阴性样品,以0.1%甲酸水为提取溶液,分别添加5.0、10.0和50.0 μg/kg三个水平的万古霉素、去甲万古霉素混合标准溶液,按照1.2.2项下方法,Strata-X-C固相萃取柱净化,接取3 mL洗脱液。每个水平单独测定6次,计算回收率和精密度,结果见表2。万古霉素和去甲万古霉素的平均回收率分别为85.6%～91.5%和88.9%～96.3%,相对标准偏差(RSD)分别为5.6%～9.2%和3.7%～9.2%。

2.4 实际样品的测定结果

应用本方法对15个鸡蛋样品进行了分析测定,其中万古霉素和去甲万古霉素均未检出,说明作为“最后一线”药物,万古霉素和去甲万古霉素在畜禽养殖使用上控制得较好。

3 结论

本文建立了SPE结合超高效液相色谱-质谱/质谱仪测定鸡蛋中的万古霉素和去甲万古霉素残留量的方法。本方法以0.1%甲酸水为提取溶剂,选择Strata-X-C固相萃取柱净化,基本无基质效应。同时,万古霉素和去甲万古霉素在5.0～100.0 μg/L范围内具有良好的线性关系,检出限均为2.0 μg/kg,定量限均为5.0 μg/kg,万古霉素和去甲万古霉素的平均回收率分别为85.6%～91.5%和88.9%～96.3%,相对标准偏差(RSD)分别为5.6%～9.2%和3.7%～9.2%,符合技术要求。本方法具有选择性好、操作简单、灵敏度高、回收率稳定等优点,适用于鸡蛋中万古霉素和去甲万古霉素的测定。