酶解法提取铜藻中海藻酸钠的工艺优化及物料分析

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(1.山东省海洋生物研究院,山东青岛 266104;2.山东省大型海藻资源保护与应用工程技术研究中心,山东青岛 266104)

铜藻(Sargassumhorneri)俗称“丁香屋”,属于褐藻门(Phaeophyta)褐藻纲(Phaeophyceae)墨角藻目(Fulcales)马尾藻科(Sargassaceae)马尾藻属(Saragassum)[1]。铜藻为北太平洋西部特有的暖温性海藻,在我国主要分布于辽宁、浙江、福建和广东等沿海地区[2]。铜藻具有较高的生态价值,是构成潮下带海藻场的重要种类之一,可以为海洋生物如鱼类、贝类等提供繁育场所[3-5]。现阶段铜藻研究的热点主要集中在资源调查及其形态学、生活史、人工增殖和繁殖等方面,在开发利用方面的研究尚处于初级阶段[6-8],因此利用率较低,铜藻含有丰富的海藻酸,含量可达22.1%,接近海带中海藻酸钠的含量(24.5%)[9],可以作为藻胶工业的原料。

海藻酸是细胞壁的主要填充物质,市场上多以钠盐出售,即海藻酸钠(sodium alginate,AGS)[10-11],广泛应用于食品、纺织、橡胶、医药等领域[12]。长期以来,海带(Saccharinajaponica)都是我国褐藻胶工业的主要原料[13],但随着海带价格的不断上涨,褐藻胶加工逐渐转向巨藻(Macrocystispyrifera)、泡叶藻(Ascophyllumnodosum)等国际原料藻[14]。目前对铜藻提取海藻酸钠的报道,仅有王作芸等[15]分离纯化了铜藻的海藻酸钠、褐藻淀粉等成分,但对最适的分离和纯化条件未进行深入探讨;王其东等[16]应用铜藻海藻酸钠作为鱼糜保水剂进行鱼糜产品的开发,未涉及提取工艺。

海藻酸钠的传统生产工艺为有机体系浸泡后再消化,耗能耗水量大,溶剂排放还会造成环境危害;以往的酶解法多采用纤维素酶作为单一酶进行酶解[17-20],成本较高,且效果不佳;复合酶法仅见田洪芸等和李德茂等[21-22]的研究,且采用的是分步法进行酶解。本研究以铜藻为原料,利用复合酶解法同步加入复合酶,简化了操作流程,优化了提取工艺,通过提取率、细胞壁结构变化及耗费物料对比了传统工艺和复合酶解法的差异,为铜藻资源的开发利用提供新方向,也为进一步开发酶解法提取海藻酸钠奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铜藻 山东荣成俚岛;果胶酶((6×104U/g)、木瓜蛋白酶(80×104U/g)、纤维素酶(2×104U/g) 庞博生物工程有限公司;水解酶(20×104U/g)、纤维素酶Ⅱ(20×104U/g) 诺维信酶制剂公司;果胶酶Ⅱ(6×104U/g)、酸性蛋白酶(10×104U/g)、纤维素酶Ⅲ(20×104U/g) 隆科特酶制剂有限公司;无水碳酸钠、盐酸、无水乙醇、无水氯化钙、醋酸钙、氢氧化钠 分析纯,国药集团。

FW80-1粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;PHS-3E pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 河南省予华仪器有限公司;YLD-6000电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;S-340N型扫描电子显微镜 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 海藻的采集与处理 2018年5月,选择生长旺盛、藻体完整的铜藻成体进行采集。采集的铜藻用过滤海水洗刷干净,60 ℃烘干,粉碎,过40目筛,装入自封袋,置于冰箱中-20 ℃保存备用。

1.2.2 酶解法提取海藻酸钠 按照酶解、消化、钙析、酸化和醇沉的工艺进行,具体如下:铜藻粉按料液比1∶20 (mg/L)加入水和一定比例的酶,调节pH、温度,进行酶解;加入溶液质量2%的碳酸钠,60 ℃保持2.5 h进行碱消化;调pH至6～7,加入10%氯化钙溶液,静置0.5 h后过滤收集沉淀;沉淀加入6 mol/L的盐酸酸化两次,每次0.5 h,形成海藻酸;过滤收集沉淀,加入碳酸钠中和,形成海藻酸钠;用等体积乙醇进行脱水,收集沉淀物放入55 ℃烘箱中烘干,称量并检测。

1.2.3 传统工艺提取海藻酸钠 铜藻粉以0.5%的甲醛固色4 h,之后冲洗干净,按照1.2.2酶解法中的消化、钙析、酸化和醇沉工艺流程进行试验[23]。

1.2.4 不同酶制剂酶解效果的比较 为筛选海藻酸钠得率较高的酶,分别加入果胶酶Ⅰ(A)、木瓜蛋白酶(B)、纤维素酶Ⅱ(C)、水解酶(D)、纤维素酶Ⅱ(E)、果胶酶Ⅱ(F)、酸性蛋白酶(G)和纤维素酶Ⅲ(H),按照各自的最佳酶解条件(见表1),料液比1∶20,酶解2 h,以海藻酸钠得率为指标,考察不同酶制剂对得率的影响。

表1 不同酶的最佳水解条件Table 1 Optimal hydrolysis conditions of different enzymes

1.2.5 单因素实验 以海藻酸钠得率为指标,分别加入水解酶和纤维素酶Ⅱ,考察酶添加量、酶解温度、pH和时间各因素对提取率的影响。

1.2.5.1 酶添加量 分别加入铜藻干重0.6%、0.8%、1%、4%的水解酶,0.6%、0.8%、1%、4%的纤维素酶,调节pH至5.0,55 ℃酶解2 h,制备海藻酸钠,计算得率。

1.2.5.2 酶解时间 固定酶添加量,依次为水解酶0.6%,纤维素酶Ⅱ0.6%,调节pH至4.0,55 ℃酶解30、60、90、120、150 min,制备海藻酸钠,计算得率。

1.2.5.3 酶解温度 固定酶添加量,依次为水解酶0.6%,纤维素酶Ⅱ0.6%,调节pH至5.0,分别置于45、50、55、60 ℃酶解2 h,制备海藻酸钠,计算得率。

1.2.5.4 pH 固定酶添加量,依次为水解酶0.6%,纤维素酶Ⅱ0.6%,调节pH依次为4.0、4.5、5、5.5、6.0,55 ℃酶解2 h,制备海藻酸钠,计算得率。

以上实验各重复3次。

1.2.6 海藻酸钠酶解条件的正交实验 根据单因素优化实验结果,选用水解酶:纤维素酶Ⅱ的比例(A)、时间(B)、温度(C)、pH(D)4个因素做L9(43)正交表进行条件优化,最终确定酶解法的最佳工艺条件。每个试验重复3次。

表2 正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 海藻酸钠得率的测定 准确称量海藻酸钠提取样品1.0 g,加入2 mol/L盐酸30 mL,充分搅拌后静置过夜,用蒸馏水冲洗至无氯离子为止。加入0.1 mol/L醋酸钙30 mL,充分搅拌,反应2 h,酚酞做指示剂,用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定[24]。

海藻酸钠得率=(C×V×0.2160)×100%/m

式中:C为氢氧化钠的摩尔浓度,mol/L;V为滴定消耗的氢氧化钠体积,mL;0.2160表示0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液1.0 mL相当于0.2160 g海藻酸钠;m为样品质量，g。

1.2.8 电镜扫描样品的制备 分别将经复合酶提取法和有机试剂浸提处理后的铜藻渣用戊二醛溶液浸泡固定2 h,之后将样本置于0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.4)中20 min,用30%～100%的酒精梯度洗脱,醋酸异戊酯置换,临界点二氧化碳干燥,离子溅射喷金20 s[25],置于环境扫描电镜下观察放大1500倍和3000倍时藻渣形态[26]。

1.3 数据处理与分析

试验数据用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,采用Origin Pro8软件作图。

2 结果与分析

2.1 酶制剂的确定

选定8种酶,分别测得海藻酸钠的得率,如图1所示。结果表明,各种酶对铜藻均具有一定的酶解效果,海藻酸钠的得率依次为水解酶(D)>纤维素酶Ⅱ(E)>酸性蛋白酶(G)>木瓜蛋白酶(B)>纤维素酶Ⅰ(C)>纤维素酶Ⅲ(H)>果胶酶Ⅰ(A)>果胶酶Ⅱ(F),其中水解酶(D)和纤维素酶Ⅱ(E)效果较好,海藻酸钠得率分别为15.92%和13.26%。海藻酸主要存在于细胞壁中,而细胞壁及细胞壁间质主要成分为果胶和纤维素[27],同时还存在大量的蛋白质[28]。纤维素酶和水解酶(果胶酶和木聚糖酶的复合物)均能加速细胞组织的崩解,提高酶解效果,因此选择水解酶和纤维素酶Ⅱ为考察对象,进行后续研究。

图1 不同酶提取海藻酸钠的效果Fig.1 Effect of different enzymes on the yield rate of AGS

2.2 单因素实验

2.2.1 酶添加量对得率的影响 由图2可知,海藻酸钠的提取率随着水解酶添加量的增加先升高后降低,在酶添加量为0.8%时,提取率最高;随着纤维素酶Ⅱ添加量的增加,海藻酸钠的提取率持续增加,当酶添加量达到1%后,提取率提高减缓。酶用量过低会导致反应物不能完全反应,酶用量过高则会抑制酶促反应的发生,本试验条件下两种酶的适宜添加量分别为0.8%和1%。综合考虑,选择水解酶∶纤维素酶Ⅱ的添加比例分别为0.8%∶1%、1%∶1%和1%∶0.8%进行正交试验。

图2 酶添加量对海藻酸钠得率的影响Fig.2 Effect of enzyme concentrations on the yield rate of AGS

2.2.2 酶解时间对得率的影响 由图3可知,海藻酸钠的得率随着时间的延长呈上升趋势,纤维素酶Ⅱ和水解酶在酶解时间达到120 min后,得率增长幅度趋于平缓。时间太短,酶活力没有被充分利用;而时间长会导致部分酶失去活性,考虑到经济效益和提取率,酶解时间选择90 min。正交实验选择60、90和120 min三个水平。

图3 酶解时间对海藻酸钠得率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on the yield rate of AGS

2.2.3 酶解温度对得率的影响 由图4可知,纤维素酶Ⅱ和水解酶的得率随温度的升高呈先上升后下降的趋势,在55 ℃时,得率最高。酶解温度过低,酶活力低;酶解温度过高,会导致酶失去活性或丧失活性。综合考虑,选择50、55和60 ℃三个水平进行正交试验。

图4 酶解温度对海藻酸钠得率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the yield rate of AGS

2.2.4 pH对得率的影响 由图5可知,水解酶和纤维素酶Ⅱ的得率分别在pH为4.5和5时达到最高。pH影响酶的稳定性,改变pH会影响酶分子的空间构象、基团解离状况、酶分子及底物的结合状态等,从而影响酶解反应[29]。从酶作用效果等方面综合考虑,选择小范围变化的pH4.0、4.5和5.0作为三个水平进行正交试验。

图5 pH对海藻酸钠得率的影响Fig.5 Effect of pH on the yield rate of AGS

2.3 正交试验结果

表3 正交实验L9(43)结果Table 3 Results of orthogonal experiment L9(43)

从表3可以得出,影响得率的四个因素由大到小为:C>A>D>B,即温度对得率影响最大,其次是加酶比例、pH、酶解时间,较优水平组合为A1B2C2D3。根据上述优化结果,在水解酶和纤维素酶Ⅱ比例为0.8%∶1%,pH为5,55 ℃酶解90 min的优化条件下,重复实验5次,测得其平均得率为24.51%±0.54%。传统甲醛法制备海藻酸钠的得率为16.71%±0.66%,复合酶法比传统方法得率提高了46.7%。另外,复合酶法要优于单酶酶解,得率分别比单一水解酶和纤维素酶提高了40.05%和84.84%。由此可见,裂解植物细胞壁需要多种酶类的共同作用。本研究采用复合酶同步加入的方法,与分步加入法相比,简化了反复调节温度和pH的繁琐步骤。

2.4 电镜观察

与传统工艺相比,酶解法能明显提高海藻酸钠的得率,为了进一步解释这一结果,通过扫描电镜对两种方法处理后的藻渣进行观察,结果如图6所示。

图6 不同工艺处理后的藻渣微观结构Fig.6 The internal structure of algae residue after different treatments

经甲醛处理的铜藻渣细胞壁结构较为完整,形态变化不大,而经酶解处理后的铜藻渣基本已观察不到完整的细胞壁结构,表面呈现出明显的孔洞和破碎,细胞被破坏得较为严重。通过二者细胞表观结构的比较,验证了复合酶提取法有利于破坏海藻细胞的表观结构,从而促进了酶解作用,有利于多糖的溶出,提高了海藻酸钠的提取率。

2.5 主要物料差异分析

由表4可知,以处理铜藻量10 kg为例进行计算:传统法和酶解法后期的消化、钙析、酸化、中和等工艺步骤相同,物料消耗相同,主要区别在前处理工艺。

表4 物料差异表Table 4 Table of matrial difference

其中,传统工艺中原料加水量为250 kg(料液比为1∶25 (g/mL)),总用水量为280 kg,甲醛用量为1.25 kg(浓度一般为0.5%);酶解工艺中原料加水量为200 kg(料液比1∶20 (g/mL)),总用水量为230 kg,柠檬酸用量为0.21 kg,酶用量为0.18 kg。其他物料用量两种方法基本相同。

两种方法的主要物料差异:传统法甲醛用量1.25 kg,用水量比酶解法多50 kg;酶解法酶用量0.18 kg,柠檬酸钠用量0.21 kg,海藻酸钠产量比传统法多0.78 kg。

两种方法的主要物料成本差异:传统法中甲醛1.25 kg×28元/kg=35元;酶解法中柠檬酸0.21 kg×40元/kg=8.4元,酶制剂0.18 kg×300元/kg=54元。两种方法得到的产品海藻酸钠价格差为(2.45-1.67) kg×300元/kg=234元。酶解法比传统法多得到234-(54+8.4-35)=206.6元,多消耗的成本仅相当于新增产出的(54+8.4-35)/206.6=13.26%。同时酶解法减少了稀释用水量和工业废水的排放量,综上可以看出酶解法要优于传统法。

3 结论

酶解法有效破坏了铜藻细胞壁的结构,促进了多糖的溶出,提高了海藻酸钠的得率。通过正交试验,得到最佳提取工艺为:水解酶添加量0.8%、纤维素酶Ⅱ添加量1%,pH为5的条件下,55 ℃酶解120 min,通过消化、脱色、钙析、酸化和醇沉等工艺制备海藻酸钠,得率可达到24.51%±0.54%,较传统工艺提高了46.7%,为铜藻的高值化加工提供有效的技术途径。要实现海藻酸钠的酶解制备的大规模工业生产,还需要进一步研发高活性、高纯度的酶制剂,以降低酶用量,提高酶解效能,从而达到降低成本,提高生产能力的目的。