响应面法优化腌制大黄鱼的低钠复合咸味剂配方

陶文斌,2,吴燕燕,*,李春生,杨贤庆,林婉玲,荣 辉

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业农村部水产品加工重点实验室,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

大黄鱼(Larimichthyscrocea)是我国主要的海水养殖鱼类,2017年中国大黄鱼养殖总量已达到17.76万吨,产量连续几年居海水养殖鱼类首位[1]。养殖大黄鱼的鱼肉具有高蛋白高脂肪的特点,滋味肥美,富含呈味氨基酸和高不饱和脂肪酸,鱼肉中必需氨基酸含量符合WHO/FAO的推荐标准[2]。食盐是人们日常生活中的咸味剂,在人体中血液的酸碱平衡、血液与细胞间的渗透压以及神经细胞间冲动的传递等起着重要的作用,食盐还能够改变食品的加工特性,延长食品货架期。利用食盐腌制食品具有悠久的历史,如火腿、培根、灌肠、腊肉、板鸭、咸蛋、咸鱼等多种制品。鱼类的腌干制产品是最具独特风味的传统水产加工食品,目前大黄鱼腌制品以黄鱼鲞最为出名[3]。但长期摄入高盐膳食会引发高血压等疾病,调查发现我国北方人群钠盐摄入量高于南方,且高血压患病率也高于南方[4]。现代人对健康越来越重视,越来越提倡低盐、低钠饮食[5],如《中国居民膳食指南(2016)》建议每天人体食盐的摄入量不超过6 g[6]。然而在食物制作中减少食盐的用量也会导致食物其它参数及口感质地等发生变化[7],因此,如何优化大黄鱼的腌制条件使得减盐后的大黄鱼鱼肉口感及质地依然能够满足消费者的口味也是减盐的挑战之一。

食盐替代物的选用及减盐效果已有不少研究。当细胞外液中的K+离子浓度的升高,会使肾小管对Na+的重吸收作用受到抑制,增加尿钠排泄而使血压降低;刺激血清中钠泵及钾通道的开放,内皮细胞的超极化使得血管舒张而降低血压[8]。所以钾盐是首选的食盐替代物。其次是镁盐[9]、钙盐[10]、苹果酸钠[11]、葡萄糖酸钠[12]等非钠盐类。然而大量使用氯化钾、氯化镁等非钠盐类作为替代盐会导致食品咸味降低并出现金属苦味,降低食品的可接受度。另外还具有咸味的物质有谷氨酸钠[13](MSG)和咸味肽[14]等氨基酸衍生物及肽类物质,以及植物盐替代物(PSS)[15]、有机酸混合物(InbacTM)[16]等新型咸味物质。但是这些新型咸味物质大多数处于实验阶段,尚未能进行广泛应用。酵母提取物(yeast extract,YE)[17-18]是由面包酵母、啤酒酵母、torula酵母或kluyveromyces酵母等酵母菌,在特定条件下通过自溶过程中细胞内核酸、蛋白质和其他大分子化合物的降解产生氨基酸和核苷酸等风味物质而产生,酵母提取物产品通常以液体、糊状或粉末的形式。酵母提取物是一种优良的天然调味品,广泛用于制作食品的原料,通常以液体、糊状或粉末的形式存在。西班牙Chemital有限公司制造的低钠盐ArtisaltTM中含有酵母提取物,可以替代全部(100%)或部分(50%)食盐而不会产生任何异味,且能溶解肌肉蛋白[16]。

目前大黄鱼主要以冷冻和腌制加工为主[19],黄鱼鲞含盐量较高,长期食用对于人体健康不利,所以有必要开发低钠复合咸味剂腌制的大黄鱼加工产品。但腌制大黄鱼如果盐含量较低,则容易被微生物污染而变质,而且也影响产品的品质和风味,因此本研究旨在开发一种低钠复合咸味剂来腌制大黄鱼,在单因素实验基础上，结合响应面试验，优化低钠复合咸味剂的最佳配方，使腌制产品实现低钠低盐、具有较好风味且能抑制或延缓微生物生长。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜活养殖大黄鱼 每条质量500～600 g,福建省宁德市金盛水产有限公司。

低钠盐(氯化钠89%、氯化钾11%) 华润万家超市;酵母提取物(安琪FIG/KU系列高鲜型酵母抽提物,水分≤6%,含盐量0%～15%,天然I+G含量2%～20%,100%的水溶性,食品级) 湖北武汉安琪酵母股份有限公司;壳聚糖(脱乙酰度≥95%,食品级) 广州馨之味食品配料有限公司。

3-550A型高温马弗炉 美国Ney VULCAN公司;Titrando 809型自动电位滴定仪 瑞士Metrohm;Brookfield QTS-25质构仪 美国CNS FARNELL公司;DKN612C干燥箱 日本YAMATO公司;Agilent 7900电感耦合等离子体质谱仪 美国安捷伦公司;CEM MARS5高压高通量微波消解装置 美国CEM有限公司;Milli-Q超纯水系统 美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 腌制方法 将大黄鱼洗净,去内脏和鱼鳞,取鱼片并修剪成12 cm×6 cm×1 cm的形状,取鱼片重量的7.5%的低钠复合咸味剂,鱼片与低钠复合咸味制溶液(腌制液)比例1∶2 (g/mL),先将低钠复合咸味剂溶于水中制成腌制液,然后放入鱼片,在0～4 ℃下腌制3.5 h。其中低钠复合咸味剂Ⅰ(低钠盐+YE)直接溶于水中制成腌制液;低钠复合咸味Ⅱ(低钠盐+壳聚糖),壳聚糖是酸溶性物质，需先将壳聚糖溶于少量1%醋酸中[20],后再加入水制成腌制液。

1.2.2 单因素实验 设计单因素实验,以感官评分、含盐量、水分、质构、菌落总数为考察指标,通过(Ⅰ)低钠盐与YE的单因素实验和(Ⅱ)低钠盐与壳聚糖的单因素实验确定YE和壳聚糖的最佳添加量。

表1 低钠盐分别与YE酵母提取物、壳聚糖的添加量组合Table 1 The addition amount of low sodium salt,YE yeast extract and chitosan

1.2.3 响应面法优化复合咸味剂配方 在上述低钠盐与YE及壳聚糖组合腌制大黄鱼片对大黄鱼片的感官品质、含盐量、水分含量、质构影响的单因素实验所确定每个因素的较佳范围基础上,根据Box-Behnken中心设计原理,通过响应面法进一步优化低钠盐、YE、壳聚糖的最佳配比。选择低钠盐(A)、YE(B)、壳聚糖(C)为自变量,感官评价及含盐量为响应值。因素水平取值及编码见表2,每个实验重复三次,结果取平均值。

表2 响应面试验因素水平表Table 2 Factor and level of response surface experiment

1.2.4 含盐量的测定 按照GB 5009.44-2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》[21]。

1.2.5 钠含量的测定 按照GB 5009.91-2017《食品安全国家标准 食品中钾、钠的测定》[22]。

1.2.6 水分含量的测定 按照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》[23]。

1.2.7 质构的测定 使用Brookfield QTS-25质构仪以及P/5平底圆柱形探头进行测定,参考杨华等[24]方法，使用测试模式为质地多面剖析(TPA)模式,测试速度为0.5 mm/s,返回速度为0.5 mm/s,循环次数为2次,触发点负载为5.0 g。每组实验重复8次,结果取平均值。

1.2.8 感官评定 大黄鱼片腌制完成后,将其蒸熟(待蒸锅中的水沸腾后将鱼片放入,蒸8 min),进行感官评定。感官评定小组由10位有经验的感官评价员组成,对产品的外观、异味、滋味、质地四方面进行评价,总分为100分,评价标准如表3所示[25-26]。

表3 感官评定标准Table 3 Sensory evaluation standard

1.2.9 菌落总数的测定 根据GB 4789.2-2016《食品微生物学检验-菌落总数测定》[27]进行。

1.4 数据分析

用Excel 2016软件处理数据,再用SPSS 22统计分析软件对各参数进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 低钠盐与YE添加量对大黄鱼片品质的影响

2.1.1 产品含盐量与感官评价 由图1可见随着低钠盐用量的降低和YE添加量的增加,鱼肉的含盐量总体呈现下降趋势。随着YE添加量的不断增加,鱼肉的感官评分呈现先上升后下降的趋势,其中第3组(低钠盐7.1%,YE 0.4%添加量)的感官评分最高。低钠盐中钾含量增加的同时会给食品带来感官上的苦味,可以使用有机酸补偿因减少氯化钠而产生的咸味下降并掩盖苦味[28]。而YE不仅能够放大人体味觉的受体接受度,而且还能放大对钠离子的接受度[29]。同时还能掩盖苦味和异味,增强食品的口感满意度[30]。所以,在添加适量酵母提取物的情况下,尽管食盐用量减少,但是人体对于咸味及鲜味的感受度没有显著的变化,即低盐食品在添加酵母提取物后依然能够满足消费者对鲜味及咸味的需求。本研究低钠盐与YE的的单因素实验中,第2组样品的感官评分比第1组高,其中两组在咸味方面几乎相似,而第2组样品因YE的添加而具有一定的鲜味,使得在整体口感方面更好,即添加YE能使增加产品的鲜味。第3组的样品感官评分最高,样品具有鲜味,且咸味适宜。从第4组开始感官评分呈现下降趋势的主要原因是感官上表现为鱼肉的咸味逐渐上升,咸味使人难以接受,因而滋味的分数较低,而色泽、气味及质地方面在感官上并无明显差别,但是依然能保持较高程度的鲜味。这也说明本研究所用的酵母提取物拥有较强的增咸增鲜能力。

2.1.2 产品质构特性与水分含量 腌制过程使鱼肉蛋白质变性,鱼肉质地也发生变化。随着YE添加量的不断增加,低钠盐的含量不断减少,鱼片的硬度呈先下降后上升的趋势(表4)。从数据分析上可以看出,YE的添加量超过0.6%后对产品的硬度有显著性的影响(P<0.05),表现为硬度较大幅度降低。另外,随着YE添加量的不断增加,低钠盐的含量不断减少,鱼肉的水分含量呈现先上升再下降的趋势(图2),与硬度呈现先下降后上升的趋势(表4)一致。这一方面是食盐含量减少,在一定程度上对鱼肉蛋白变性的影响降低,所以鱼肉硬度下降,另一方面,当YE用量较大时,由于其是酵母提取物,当量较大时也能溶解鱼肉蛋白[16],所以YE用量在达到1.4%时产品硬度开始增大。添加YE对产品的弹性及咀嚼性有显著性的影响(P<0.05),而随着YE添加量的不断增加,对产品的弹性及咀嚼性无显著性的影响(P>0.05)。综上所述,YE的添加量选择0.4%为宜。

表4 低钠盐与YE添加量对大黄鱼片质构的影响Table 4 Effects of addition of low sodium salt and YE on texture of Larimichthys croaker fillets

注:表中数据以平均值±标准差表示。同一列数值上标不同字母表示差异显著(P<0.05),下同。

图2 低钠盐与YE添加量对大黄鱼片水分的影响Fig.2 Effects of addition of low sodium salt and YE on water content of Larimichthys croaker fillets

2.2 低钠盐与壳聚糖添加量对大黄鱼片品质的影响

2.2.1 感官评价及含盐量 壳聚糖是N-脱乙酰化形式的甲壳素和具有不同程度N-乙酰化的线性多糖[31],具有抑制微生物活性的能力,且本身不含有盐分。随着低钠盐的用量逐渐下降,各组的含盐量也在不断下降(图3)。而产品的感官评分整体上呈现先上升后下降的趋势,评分高于70分的是第4、5、6、7组,含盐量在2.92%～3.11%范围内。其中第5组的感官评分最高,达到76.25分,含盐量为3.04%(图3)。而第1、2、3组由于含盐量较高,鱼肉表现为咸味太重,从而导致感官评分较低;第8组的鱼肉由于含盐量太低,鱼肉表现为咸味太淡,从而导致感官评分较低。因为壳聚糖不提供盐分和咸味,所以产品含盐量在2.92%～3.11%范围内时咸味适宜,同时感官评分较高。这也说明影响该组单因素实验中鱼肉感官评分的主要因素是咸味,而壳聚糖对感官评分几乎没有影响。

图3 低钠盐与壳聚糖添加量对大黄鱼片感官评分及含盐量的影响Fig.3 Effects of addition of low sodium salt and chitosan on sensory score and salt content of Larimichthys croaker fillets

2.2.2 质构特性与水分 在食盐添加量一定的情况下,随着壳聚糖的添加量不断增加,产品的硬度、弹性和咀嚼性呈现先下降后升的趋势(表5)。数据分析可知,当壳聚糖的添加量超过0.5%后对产品的硬度有显著性的影响(P<0.05)。而产品的水分含量呈现先上升后缓慢下降的趋势(图4)。壳聚糖的添加量为0.5%～1.7%时产品的弹性及咀嚼性均无显著性差异(P>0.05)。

图4 低钠盐与壳聚糖添加量对大黄鱼片水分的影响Fig.4 Effects of addition of low sodium salt and chitosan on water content of Larimichthys croaker fillets

不断增加的壳聚糖添加量在鱼肉表面形成一层膜,减少了水分的流失,所以鱼肉的硬度较小,至1.2%时硬度最低。另外,图4中各组水分含量值在73.72%～74.34%,数据波动不大,说明其有一定保水功能。而当添加量在1.7～2.0%时,硬度有所回升。可能的原因是壳聚糖是甲壳素经脱乙酰反应后得到的,脱乙酰基程度(D.D)表征了分子链上胺基(NH2)含量的多少。随着D.D增加,由于胺基质子化而使壳聚糖在稀酸溶液中带电基团增多,聚电解质电荷密度增加,导致鱼肉蛋白质的结构发生变化。本实验所用的壳聚糖脱乙酰度为95%以上,所以其用量增加时,影响鱼肉蛋白使其容易变性,所以鱼肉硬度略有增加。然而当壳聚糖用量超过1.2%后,鱼肉硬度开始增加,但并没有超过未加壳聚糖时鱼肉的硬度,其中机理尚不明确,有待于进一步研究。

表5 低钠盐与壳聚糖添加量对大黄鱼片质构的影响Table 5 Effects of addition of low sodium salt and chitosan on texture of Larimichthys croaker fillets

2.2.3 菌落总数 在食盐添加量一定的情况下,随着壳聚糖的添加量不断增加,产品的菌落总数值呈现逐渐下降的趋势(图5)。壳聚糖的添加量为0.5%～1.2%(第2组～第4组)时，产品的菌落总数无显著性差异(P>0.05);壳聚糖的添加量超过1.2%后对产品的菌落总数有显著性的影响(P<0.05),壳聚糖的添加量为1.5%～1.7%时产品的菌落总数无显著性差异(P>0.05)，壳聚糖添加量超过1.7%后产品菌落总数显著降低(P<0.05)。从菌落总数下降幅度来看,图5中有三处菌落总数呈现明显下降的趋势,即壳聚糖的添加量分别为0.5%、1.5%、2.0%。因此,壳聚糖的添加量不小于1.5%时的抑菌保鲜效果更好,考虑到成本问题,壳聚糖的添加量选择1.5%(第6组,低钠盐∶壳聚糖为5.5∶1.5)为宜。

添加壳聚糖主要用于产品防腐,则应选择壳聚糖的添加量选择1.5%为宜,当壳聚糖的添加量为1.5%时,对产品的水分及质构参数无明显差异(P>0.05),并且感官评分仅次于最高的第5组。综上所述,壳聚糖的添加量选择1.5%为宜。

图5 低钠盐与壳聚糖添加量对大黄鱼片菌落总数的影响Fig.5 Effects of addition of market low sodium salt and chitosan on total number ofcolonies of Larimichthys croaker fillets

2.3 响应面法优化低钠复合咸味剂腌制大黄鱼片的配比参数

2.3.1 响应面法试验结果分析 根据Box-Behnken中心设计原理,基于单因素实验,选择A(低钠盐添加量)、B(YE添加量)、C(壳聚糖添加量)为自变量,选用感官评分及含盐量作为响应值设计实验(表6)。

表6 响应面法优化实验设计和结果Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken design

2.3.2 响应面模型建立及方差分析 利用Design Expert软件对响应面法优化实验得到的感官评分及含盐量的数据(表6)进行多元拟合回归分析,结果如下。

感官评分的二次多项回归方程为:

Y1=-246.908+66.789A+196.08B+84.19C-10.85AB-1.25AC+1.625BC-3.929A2-160.725B2-59.6C2

注:**表示极显著(P<0.001);*表示显著(P<0.05),表8同。

表8 含盐量的方差分析结果Table 8 Analysis of variance for salt content

含盐量的二次多项回归方程为:

Y2=-15.08831+3.65775A+4.13625B+6.63375C+0.0875AB-0.2AC-2.875BC-0.21775A2-3.19375B2-2.88125C2

2.3.3 响应面交互作用分析 利用Design Expert软件对实验结果进行回归拟合分析,制作三维曲面图(图6～图7)。曲面图中曲线的变化弧度越大,则因素对响应值的影响越大[32]。曲面图中等高线形状可直观反映两个因素之间的交互作用强弱,通常形状呈现椭圆形则交互作用显著,呈现圆形则交互作用不显著[33]。

图6显示,因素B的响应面弧度最大,因素A次之,因素C的趋于平缓而影响最小。因此,三个因素对产品感官评分产生的影响由大到小依此为:B(YE添加量)>C(壳聚糖添加量)>A(低钠盐添加量),这与表7中的方差分析结果一致。从等高线形状来看,低钠盐添加量与YE添加量、低钠盐添加量与壳聚糖添加量、YE添加量与壳聚糖添加量均有不同程度的交互作用,其中低钠盐添加量与YE添加量的交互作用更强,说明两种因素的交互作用对感官评分的影响显著。

图7显示,因素A的响应面弧度最大,因素B次之,因素C的影响最小。因此,三个因素对产品含盐量产生的影响由大到小依此为:A(低钠盐添加量)>B(YE添加量)>C(壳聚糖添加量),这与表8中的方差分析结果一致。从各响应面坡度来看,低钠盐添加量与YE添加量、低钠盐添加量与壳聚糖添加量、YE添加量与壳聚糖添加量均有不同程度的交互作用,其中YE添加量与壳聚糖添加量的交互作用更强,说明两因素间的交互作用对含盐量的影响显著。

图7 各因素交互作用对含盐量影响的响应面分析图Fig.7 Response surface analysis of the influence of various factors on salt content

2.4 模型验证

通过Design Expert软件对感官评分及含盐量两种响应值的实验结果进行优化预测,得出最佳配方比例为低钠盐添加量7.57%,YE酵母提取物添加量0.39%,壳聚糖添加量1.48%。设置对照组为氯化钠7.5%,对模型的准确性进行验证,重复3次,取平均值。结果显示,优化后产品的感官评分为75.83分,含盐量为3.02%,与模型预测值相近,说明得到的响应面实验模型可以用于实际值的预测。对照组的钠含量为184.76 mg/100 g,而优化后产品的钠含量为140.79 mg/100 g,比对照组减少了23.80%,降钠效果良好。菌落总数结果为3.33 lg(CFU/g),比对照组(3.56 lg(CFU/g))低;从菌落个数来看,比对照组减少近39.98%。

3 结论

本研究表明YE和壳聚糖分别与低钠盐组合均能达到低钠、低盐和抑制细菌生长的目的。以感官评分和含盐量作为响应值,响应面法优化低钠盐、YE和壳聚糖的用量,获得低钠盐、YE和壳聚糖的最佳用量配比:低钠盐添加量7.57%，YE酵母提取物添加量0.39%，壳聚糖添加量1.48%。使用该优化配方比例得到的腌制大黄鱼片,感官评分为75.83分,含盐量为3.02%;钠含量为140.79 mg/100 g,比对照组减少了23.80%,具有良好的减钠效果;同时也使产品鲜度得以提升,口感和品质更佳;菌落总数结果为3.33 lg(CFU/g),比对照组降低了39.98%。因此,用该低钠复合咸味剂腌制大黄鱼,不仅能使腌制大黄鱼的食盐含量较低,且钠离子含量较低,菌落总数低,产品鲜度和品质得到较好地提升,从而为黄鱼鲞的加工提供新的工艺技术,开发满足不同人群需求的大黄鱼腌制产品。