胃癌患者癌组织及血清中lncRNA EXOC7的表达及其临床意义

刘 谦，夏兴洲，李金丽，王文真，李冲慧，王万聪

郑州大学第五附属医院消化内科，河南 郑州 450000

临床中，胃癌已成为常见恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率呈逐年上升趋势[1]。由于胃癌早期症状隐匿，加上我国内窥镜筛查率低等种种原因，导致多数患者在确诊时已处于晚期[2]，而且，虽然手术结合放化疗的治疗方式可大大提高早期胃癌患者的治愈率，但晚期胃癌患者预后较差[3]，因此，探究胃癌早期诊断及治疗靶标具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)为不编码蛋白质RNA，其长度超过200核苷酸[4]。既往研究显示，lncRNA与胚胎发育、新陈代谢等存在相关性[5-7]。本课题组前期利用lncRNA表达谱芯片发现，与癌旁组织相比，胃癌组织中lncRNA EXOC7的表达显著升高。因此，本文进一步探讨了lncRNA EXOC7与胃癌临床病理特征的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取郑州大学第五附属医院2016年1月至2018年6月收治的原发性胃癌患者134例，经手术病理确诊，均接受手术治疗，且术前均未接受放疗、化疗等辅助治疗。134例胃癌患者中，男73例，女61例，年龄(61.72±11.53)岁(37～74岁)；肿瘤位置：贲门26例，胃体43例，胃窦65例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期29例，Ⅲ期81例，Ⅳ期13例；分化程度：高分化22例，中分化28例，低分化84例；有淋巴结转移者61例；有深层浸润者49例；有脉管癌栓者79例。另将同期在我院体检的80名体检正常者作为对照组，男47例，女33例，年龄(60.18±10.69)岁(35～72岁)。两组一般资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 样本采集：胃癌患者术中取癌组织及对应癌旁组织(距癌组织边缘≥1 cm)作对照组织，样本采集后立即经液氮冷冻，并置于-80 ℃保存待用。所有癌旁组织样本均经病理证实为正常胃组织。胃癌组和对照组均于清晨采集空腹外周静脉血4 ml，室温静置30 min，1 500 r/min离心10 min，取上层血清于-80 ℃保存待检，整个过程避免溶血。

1.2.2 试剂与仪器：RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；SYBR Green Ⅱ荧光定量PCR试剂盒由TaKaRa公司提供；lncRNA EXOC7引物由上海生工生物工程有限公司合成；实时定量聚合酶链反应(qPCR)仪购自ABI公司；Nanodrop分子检测仪器购自Thermo Fisher公司。

1.2.3 检测方法：取50 mg组织样本经超声匀浆或1 ml血清，按RNA提取试剂盒步骤提取基因组RNA，使用Nanodrop分子检测仪测定RNA浓度和质量，当RNA浓度>50 ng/μl，OD260/OD280值为1.8～2.1，认为样本质量良好[8]。然后配制逆转录反应体系，其中500 nmol/L逆转录引物2 μl、模板RNA 1 μl、逆转录缓冲液2 μl、10 mmol/L dNTPs 2.5 μl、30 U/μl RNA酶抑制剂0.1 μl、10×RT buffer 1.5 μl，DEPC水补至20 μl。反应条件：20 ℃退火15 min，37 ℃逆转录60 min，95 ℃灭活5 min，逆转录产物-20 ℃保存。qPCR反应体系：逆转录产物3 μl、上游引物及下游引物各1 μl、SYBR Green Ⅱ Mix 10 μl，DEPC水补至20 μl。每组设置3个复孔，反应条件：95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35个循环。采用2-△△CT公式计算lncRNA EXOC7表达水平，以β-actin为内参，每组取3个复孔均值，根据各样本的平均Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因表达水平，lncRNA EXOC7相对表达量=2-ΔΔCt值(lncRNA EXOC7)-2-ΔΔCt值(β-actin)。

2 结果

2.1 胃癌患者癌组织及血清中lncRNA EXOC7的表达情况qRT-PCR结果显示，胃癌组织中lncRNA EXOC7的相对表达量明显高于癌旁组织，且差异有统计学意义(8.24±1.86vs2.37±0.81，t=33.494，P=0.000)(见图1)；胃癌患者血清中lncRNA EXOC7的相对表达量明显高于对照组，差异有统计学意义(4.29±0.47vs0.92±0.23，t=74.553，P=0.000)(见图2)。

2.2 癌组织及血清中lncRNA EXOC7的表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系不同性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置的患者胃癌组织及血清中lncRNA EXOC7表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但胃癌患者血清及癌组织中lncRNA EXOC7在不同临床分期、浸润深度、分化程度及有无脉管癌栓、淋巴结转移中的表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)，即TNM分期越高、分化程度越低、浸润深度越深、有淋巴结转移、有脉管癌栓的患者，其胃癌组织及血清中lncRNA EXOC7表达水平越高(见表1)。

图1 胃癌组织与癌旁组织中lncRNA EXOC7表达水平的比较；图2 两组血清中lncRNA EXOC7表达水平的比较

临床病理特征例数癌组织中lncRNA EXOC7表达t/F值P值血清中lncRNA EXOC7表达t/F值P值性别 男738.29±1.240.246>0.054.35±0.420.371>0.05 女618.17±1.334.12±0.56年龄 <60岁568.34±1.750.794>0.054.34±0.930.690>0.05 ≥60岁788.16±1.654.18±0.65肿瘤直径 ≥5 cm628.27±1.100.772>0.054.30±0.340.548>0.05 <5 cm728.21±1.254.16±0.35肿瘤位置 贲门268.34±1.190.214>0.054.25±0.420.609>0.05 胃体438.15±1.114.32±0.96 胃窦658.28±1.134.18±0.72TNM分期 Ⅰ期114.07±0.969.476<0.051.73±0.2913.378<0.05 Ⅱ期295.19±0.932.91±0.31 Ⅲ期818.93±1.824.75±0.46 Ⅳ期139.31±1.125.20±0.54分化程度 低849.62±2.5717.039<0.054.97±0.6711.248<0.05 中288.24±1.613.05±0.46 高227.05±1.761.82±0.34淋巴结转移 有618.42±1.6310.545<0.054.81±0.598.609<0.05 无738.07±0.874.12±0.64浸润深度 ≤50%肌层857.16±1.946.626<0.053.97±0.537.197<0.05 >50%肌层498.79±2.705.03±0.82脉管癌栓 有798.58±1.169.132<0.054.88±0.438.114<0.05 无557.94±1.123.73±0.51

3 讨论

临床中，lncRNA主要表达于真核细胞中，其为一类不编码蛋白质RNA，长度超过200核苷酸，其具有丰富的生物学功能[8]。据报道，lncRNA可在基因组转录及转录后、表观遗传学等层面上调控基因的表达[9-10]。临床研究表明，lncRNA参与细胞增殖、分化及生物体发育、衰老等重要过程[11-12]。既往研究显示，表达异常的lncRNA参与多种人体疾病的发生、发展[13]。最近的研究表明，lncRNA能够与RNA结合蛋白形成复合物，进而调控下游靶基因的表达，从而发挥促癌或抑癌基因的功能[14-15]，此外，lncRNA还参与了多种肿瘤的发生与发展过程[16-17]。

临床研究表明，胃癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，对患者生命健康已造成严重威胁[18]。由于胃癌早期症状隐匿，加上我国内窥镜筛查率低等原因，导致多数患者在确诊时已处于晚期，而且，尽管胃癌临床治疗措施不断完善，但大多胃癌患者确诊时已属晚期，加上其临床复发率高且易出现化疗耐药，往往患者预后不理想[19]，因此，寻找新的研究方向，进一步探究胃癌早期诊断及治疗靶标具有重要意义，而近年来引起广泛关注的lncRNA可能正是我们所要寻找的胃癌研究的突破口。目前，有研究发现，多种lncRNA在胃癌中均有表达[20]，但lncRNA与胃癌的关系尚不明确。

在本研究中，qRT-PCR检测结果显示，134例胃癌患者癌组织中lncRNA EXOC7的相对表达量明显高于癌旁组织，差异有统计学意义，这与基因芯片结果相一致；胃癌患者血清中lncRNA EXOC7的相对表达量明显高于对照组，差异有统计学意义，进一步证实了lncRNA EXOC7在胃癌患者血清及癌组织中呈高表达。通过进一步分析lncRNA EXOC7的表达与胃癌患者临床病理特征的关系发现，不同性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置的患者胃癌组织及血清中lncRNA EXOC7表达水平比较，差异均无统计学意义，但胃癌患者血清及癌组织中lncRNA EXOC7在不同临床分期、浸润深度、分化程度及有无脉管癌栓、淋巴结转移中的表达比较，差异有统计学意义，即TNM分期越高、分化程度越低、浸润深度越深、有淋巴结转移、有脉管癌栓，则患者胃癌组织及血清中lncRNA EXOC7表达水平越高，这提示lncRNA EXOC7与胃癌的恶性程度呈正相关，过表达的lncRNA EXOC7可促进肿瘤细胞的恶性转化，推测下调lncRNA EXOC7的表达可能成为临床胃癌治疗的潜在靶点。

综上所述，lncRNA EXOC7在胃癌患者血清及癌组织中均呈高表达，其与胃癌恶性程度相关，可能成为胃癌早期诊断及病情判断的潜在指标。