耐多药结核患者外周血Th1、Th2、Th17细胞及其细胞因子水平变化

叶静，吴琦，杜钟珍，梅早仙，侯志丽，李志华，孙海柏

(天津市海河医院，天津300350)

结核病是对人类健康危害严重的呼吸系统传染性疾病，已成为了世界范围内关注的公共卫生问题和社会性问题。我国结核病发病率位居世界第2位，目前实施的结核病防治规划获得良好效果，但结核病发病与死亡人数在法定报告传染性疾病中仍占首位，这与耐药结核关系密切[1]。研究显示，结核主要是T淋巴细胞特异性介导细胞免疫反应，因此临床研究重点聚焦在细胞免疫分析。Th1主要介导人体细胞免疫，可以分泌干扰素γ(IFN-γ)等细胞因子；Th2则主要介导体液免疫反应，可以分泌白细胞介素4(IL-4)、IL-5等细胞因子；生理情况下两者处于平衡和协调之中，结核的发生与两者比例失衡密切相关。Th17则属于CD4+效应T细胞亚群，不同于传统研究的Th1和Th2，具备独立的分化与基质，可以产生IL-17、IL-10等细胞因子。目前，临床对于耐多药结核(MDR-TB)患者中上述细胞亚群及其细胞因子的报道较少见[2]。本研究分析了MDR-TB患者外周血Th1、Th2、Th17细胞及其细胞因子水平变化，以期为临床提供指导和依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月～2018年12月在天津市海河医院治疗的无耐药肺结核患者67例(肺结核组)、MDR-TB患者45例(MDR-TB组)。纳入标准：①肺结核诊断符合《肺结核诊断和治疗指南》中的标准，MDR-TB符合《耐多药肺结核诊断和治疗指南》中的标准；②无HIV、HBV等其他传染病病原合并感染。排除标准：①近3个月使用过激素、免疫抑制剂等药物；②合并有糖尿病、高血压、肝肾功能障碍、血液系统异常、自身免疫系统疾病、恶性肿瘤等；③妊娠期或哺乳期妇女。肺结核组男38例、女29例，年龄(30.92±7.83)岁；MDR-TB组男25例、女20例，年龄(31.01±8.50)岁。同时选取健康志愿者80例作为对照组，男50例、女30例，年龄(31.15±8.46)岁。各组性别、年龄具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及家属知情同意。

1.2 Th1、Th2、Th17细胞及相应细胞因子检测方法 各组均采集空腹静脉血4 mL，离心(4 000 r/min)后提取血清进行分装，置-80 ℃冰箱备用。采用流式细胞仪测定Th1、Th2和Th17，选择单个核细胞后加荧光抗体避光孵育，应用PBS缓冲液冲洗，加入破膜剂，避光孵育5 min开始检测。荧光抗体均由Santa Cruz公司提供，按照说明书操作。ELISA法检测Th1细胞因子IFN-γ、Th2细胞因子IL-4和IL-5、Th17细胞因子IL-17和IL-10，试剂盒购自Camilo公司，按说明书操作。

2 结果

2.1 各组外周血Th1细胞及相应细胞因子比较 MDR-TB组外周血Th1细胞和IFN-γ水平低于对照组(P均<0.05)，与肺结核组比较差异无统计学意义。见表1。

表1 各组外周血Th1细胞及相应细胞因子比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 各组外周血Th2细胞及相应细胞因子比较 MDR-TB组外周血Th2细胞和IL-4、IL-5水平低于对照组(P均<0.05)，与肺结核组比较差异无统计学意义。见表2。

表2 各组外周血Th2细胞及相应细胞因子比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 各组外周血Th17细胞及相应细胞因子比较 MDR-TB组外周血Th17细胞和IL-10、IL-17水平高于对照组和肺结核组(P均<0.05)，肺结核组外周血Th17细胞和IL-10、IL-17水平高于对照组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组外周血Th17细胞及相应细胞因子比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与肺结核组比较，#P<0.05。

3 讨论

结核病是世界范围内主要的传染性疾病之一，病死率较高。有报道称，全球己有1/3的人群感染结核菌，每年新发病例800～1 000万[3]。随着现代医学飞速发展，越来越多的抗结核治疗药物在临床广泛应用，有效控制了结核病泛滥；但是，随着不合理用药等情况出现，造成了结核分枝杆菌耐药增加[4]。有报道认为，由于人类免疫缺陷病毒的感染流行和人群免疫水平低下等情况，结核分枝杆菌耐药性明显加重。有报道称，在世界范围内20亿感染结核菌人群中，感染耐药结核分枝杆菌者约有500万人，其中感染MDR-TB患者占耐药结核菌患者的1/5[5，6]。耐药是由于基因突变导致药物对突变菌的效力降低造成的，耐多药结核菌株的自然发生频率很低；因为病灶内出现同时耐两种或两种以上药物的野生突变株几乎不存在，所以耐药菌株的播散是造成新耐药患者的主要来源，也是重症肺结核在临床难治的重要原因之一[7]。研究还发现，复治肺结核患者耐药越来越显著，也是结核病防治工作中需要解决的重要问题。耐药性关乎治疗成败，而其影响因素复杂，通过对患者体内免疫水平变化进行分析并了解对MDR-TB患者病情的影响，对于提高治愈率是十分必要的[8，9]。

传统T细胞分类按照表面抗原差异分为辅助性T细胞与抑制性T细胞，近年来按照细胞因子产生模式与生物学功能则分为Th1、Th2和Th17。Th1可以产生IL-2、IFN和TNF，Th2则可以产生IL-4、IL-5等。辅助性T细胞可以介导细胞免疫以及细胞毒T细胞的生长与活化，因此对细胞内寄生菌的感染具有抑制作用。有研究发现，采用原位杂交法观察到蕈样肉芽肿患者Th1细胞中IL-2、IFN表达明显增多[10]；IFN则主要刺激体液免疫并促进B细胞增殖过程，可以分泌IL-4、IL-5等诱导肥大细胞与嗜酸性粒细胞分化和增殖[11]。研究表明，MDR-TB发生与Th细胞亚群失衡关系密切。研究发现，结核患者体内Th1型细胞因子低下，但Th2型细胞因子未见差异，考虑MDR-TB久治不愈可能与Th1细胞反应低下有一定关系[12]。有学者认为，以Th1细胞为主的细胞免疫功能下降和以Th2 细胞为主的体液免疫功能下降是造成结核分枝杆菌感染产生耐多药的重要原因之一。近年来大量研究发现，Th17细胞也参与到结核免疫应答与调控过程中，其分泌的促炎因子IL-17可促进中性粒细胞的分化与转移，因此在加速对结核分支杆菌二次应答与清除中具有重要意义[13]。有学者还发现，随着疾病严重程度加重、结核病灶范围增大或出现空洞，外周血Th17水平会降低，说明人体免疫机能抑制加重。在这一过程中，由于IL-17转录受阻会导致初始的T细胞发生转化，无法形成有效的保护性免疫反应[14]。MDR-TB患者由于体内细胞免疫机能长期被抑制，被结核分支杆菌抗原刺激时间长，因此形成的变化更显著。内源性的转化因子β以及IL-6等均会造成IL-17表达增加，介导炎症细胞到局部浸润并造成组织损伤[15]。对结核患者开展支气管肺泡灌洗发现，MDR-TB患者IL-17水平高于普通结核患者与对照人群。这表明Th17细胞分泌IL-17可能参与MDR-TB发病过程，为临床弥补了传统Th1/Th2介导效应中的不足，为早期诊治MDR-TB提供可能的新靶点。

本研究显示，MDR-TB组Th1细胞和IFN-γ水平低于对照组，而与肺结核组比较差异无统计学意义，说明在结核患者体内Th1细胞和IFN-γ水平明显降低。MDR-TB组Th2细胞和IL-4、IL-5水平低于对照组，而与肺结核组比较差异无统计学意义，说明在结核患者体内Th2细胞和IL-4、IL-5水平降低。MDR-TB组Th17细胞和IL-10、IL-17高于对照组和肺结核组，肺结核组高于对照组；这说明在结核患者体内存在Th17细胞和IL-10、IL-17水平升高，而在MDR-TB患者体内则升高更显著。由上可见，MDR-TB及肺结核患者Th1、Th2细胞及相应细胞因子降低，Th17细胞及相应细胞因子升高，其中Th17细胞及相应细胞因子在MDR-TB发病中有一定作用。本研究优势在于证实了MDR-TB患者体内存在细胞免疫功能异常，而且Th17细胞对于MDR-TB具有一定的鉴别意义，为临床寻找可靠的血清学指标区别MDR-TB提供了理论基础。但是，本研究纳入患者数量有限，随访时间短，因此还需长期随访、扩充样本量深入研究论证。