异氟醚吸入麻醉对大鼠认知功能及海马组织中BDNF、MMP-9、炎症因子表达的影响

孙虎，陈晓芳，王涛，薛瑞，徐志新

(1 海南医学院第二附属医院，海口570311；2 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院)

术后认知功能减退是手术常见的中枢神经系统并发症[1]，麻醉药是其常见的原因之一[2]。神经认知功能主要与中枢海马神经细胞的功能有关[3～5]，而海马神经细胞功能的强弱取决于神经胶质细胞或神经细胞合成的脑源性神经营养因子(BDNF)的水平[6，7]。血脑屏障是保护脑组织的关键，而内源性水解酶基质金属蛋白酶9(MMP-9)与屏障的通透性密切相关。在应激条件下，中枢神经系统能释放TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子，过度合成能诱导局部炎性细胞的聚集及其他相关细胞因子的级联反应，从导致中枢神经细胞损伤，引起记忆及情感功能障碍[8，9]。异氟醚(ISO)是临床上常用的吸入麻醉药[10]，有研究认为其可引起神经认知功能减退[11]，但机制尚不明确。2018年1～10月，我们观察了ISO吸入麻醉后大鼠认知功能及海马组织中BDNF、MMP-9、炎症因子表达的变化，探讨ISO对认知功能的影响及可能的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂、仪器 选取54只10周龄的健康雄性SD大鼠，体质量220～250 g，清洁级，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司(许可证号：SCXK2016-0002)；大鼠正常进食、进水，常规喂养于光照间隔12 h、室温23～25 ℃、相对湿度45%～60%的环境中。ISO(山东鲁南制药集团)；XR-XM101水迷宫系统(上海欣软科技信息公司)； LC500型动物麻醉箱(上海玉研科学仪器有限公司)；麻醉机(上海普辛仪器科技有限公司)；TNF-α、IL-6、IL-1β检测试剂盒(南京建成生物科技研究所)，ABI 2720 PCR检测仪(美国赛默飞公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与干预处理 动物适应饲养环境后以随机数字表法分为空白组、对照组及ISO组，每组18只，分笼饲养；每日大鼠放入麻醉箱15 min适应麻醉环境，7 d后进行干预处理。ISO组给予ISO吸入麻醉：呼吸机螺纹管连接麻醉箱，调节气阀压力，麻醉机输出3%的ISO，观察大鼠反应；翻正反射消失后，调节ISO输入浓度至1.8%维持麻醉，维持麻醉时间60 min；吸入麻醉过程中，大鼠吸入40%氧气和空气混合气体。对照组麻醉箱内吸入40%氧气和空气混合气体60 min，空白组麻醉箱内自由吸入空气60 min。

1.2.2 大鼠认知功能观察 采用Morris水迷宫实验。干预前3 d开始行定位航行训练，每天1次，大鼠自入水至站上站台时间为逃避潜伏期。干预前1 d行空间探索训练，记录大鼠60 min内穿越站台所在位置的次数，评估其空间记忆能力。分别干预后第1、4、7天每组取6只行迷宫训练，记录逃避潜伏期、穿越平台次数，分别评估其学习、空间记忆能力。

1.2.3 海马组织标本采集 分别于水迷宫试验后，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，低温下断头后取脑组织；切取海马并称重，深低温保存。

1.2.4 大鼠海马组织TNF-α、IL-6、IL-1β检测 采用比色法。将海马组织解融后冲洗剪碎，称取50 mg放入小烧杯中，加入9倍重量匀浆液(0.9% NaCl， Tris-HCl 0.1 mmol/L，pH 7.4，蔗糖0.01 mmol/L，EDTA-Na20.01 mol/L，)；移入匀浆器，反复研磨；加入9倍重量匀浆液，低温离心后吸取上清液。 检测板设置空白对照、标准品及样品孔，室温平衡后各孔依次加入标准品，样品孔加入组织匀浆上清液；依次加入辣根过氧化物酶标记的抗体，温育；洗涤冲板后加入底物，充分反应后加入终止液终止反应；检测各孔450 nm处的吸光度，依据标准曲线计算检测匀浆组织中相应的炎性细胞因子浓度。

1.2.5 大鼠海马组织中BDNF、MMP-9 mRNA检测 采用RT-PCR法。TRIzol法提取总RNA，以DEPC处理水溶解；加入2.5倍体积75%乙醇，无RNase的水定容至过饱和；加入Buffer OBB 和Oligotex Suspension，水浴、退火、重悬，离心提取mRNA，沉淀备用。进行逆转录，在GenBank查找目的基因序列，用Primer express 2.0 软件在CDS区设计特异性引物，用ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成引物。引物序列: BDNF上游5′-CTGTATCAAAAGGCCAACTGAA-3′，下游5′-GTGTCTATCCTTATGAATCGCCA-3′；MMP-9上游5′-GGCACATAGTAGGCCCTTTAA-3′，下游5′-TCACTCCTTTCTTCCTAGCCA-3′，内参GAPDH上游5′-GAAGGTGAAGGTcGGAGTC-3′，下游5′- GAAGATGGTGATGGGATGG-3′。PCR扩增的阳性产物行琼脂糖凝胶电泳，显示条带后割下条带、回收、纯化为阳性标准品，纯度为OD260/OD280>1.8；待测样本和阳性标准品PCR反应， 产物凝胶电泳分析(40 V电泳6 h)；以GAPDH的拷贝数作为校正基数，计算目的基因相对表达量。目的基因相对表达量=目的基因Ct值/内参照 Ct值。

2 结果

2.1 各组大鼠认知功能比较 干预第1天，ISO组逃避潜伏期长于对照组和空白组，穿越平台次数少于对照组和空白组(P均<0.05)；干预第4、7天，三组大鼠逃避潜伏期及穿越次数差异均无统计学意义。见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期及穿越次数比较

注：与对照组同时点比较，aP<0.05；与空白组同时点比较，bP<0.05。

2.2 各组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达比较 干预第1天，ISO组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平高于对照组和空白组(P均<0.05)；干预第4、7天，三组各指标差异均无统计学意义。见表2。

表2 各组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达比较

注：与对照组同时点比较，aP<0.05；与空白组同时点比较，bP<0.05。

2.3 各组大鼠海马组织中BDNF、MMP-9 mRNA表达比较 干预第1天，ISO组大鼠海马组织中BDNF mRNA表达水平低于对照组和空白组，且MMP-9 mRNA表达水平高于对照组和空白组(P均<0.05)；而干预第4、7天，三组各指标差异均无统计学意义。见表3。

3 讨论

ISO在全麻诱导和麻醉维持中应用较多，能够对中枢神经系统进行下行性抑制，能够抑制神经肌接头的冲动传导发挥肌松作用。ISO在发挥中枢抑制的同时，也能引起中枢功能的异常，如脑电异常甚至癫痫、记忆功能障碍等，但其深入的机制目前尚不完全明确。海马是中枢神经系统中与记忆、学习密切相关的部位，其生理活动与多个神经传导通路有关，有多种神经递质及细胞因子的参与，过程极为复杂；而麻醉药物对记忆及学习功能的影响，也是通过多种机制作用的结果。

学习记忆能力检查通常采用Morris水迷宫实验，包括空间位置感知和方向感知两方面来反映学习记忆功能[11]。本研究结果显示，ISO组吸入ISO麻醉后第1天，水迷宫实验潜伏期增长、穿越平台次数减少，说明吸入ISO能够引起认知功能的障碍；进一步研究发现，在干预后第4、7天，各组大鼠的水迷宫实验结果无显著差异，说明ISO引起的认知功能障碍的作用时间较短，且可完全恢复正常认知功能。

表3 各组大鼠海马组织中BDNF、MMP-9 mRNA表达比较

注：与对照组同时点比较，aP<0.05；与空白组同时点比较，bP<0.05。

近年来研究发现，脑部炎症反应是认知功能减退的主要影响因素，其中IL-6、TNF-α、IL-1β被认为典型的促炎因子[12]，上述炎性因子相互调节共同影响中枢多种功能。正常生理状态下，细胞因子参与神经系统发育、脑细胞损伤修复和自身免疫过程；但病理状态下，细胞因子通过自分泌或与其他细胞因子间的相互作用产生大量细胞因子，一旦炎症级联反应被启动，神经系统就会受到影响，甚至导致认知功能障碍。本研究发现，ISO组吸入ISO后第1天海马组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平上升，对照组及空白组各指标差异无统计学意义。这说明IL-6、IL-1β、TNF-α升高与吸入ISO有关，可能与ISO的直接作用及其引起的脑部血流动力学改变有关。在干预后第4、7天，ISO组海马组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平恢复正常，同时大鼠的认知功能也恢复正常，提示IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子可能参与了吸入ISO后认知功能障碍的发生过程。

神经元突触的完整性和信息传递的连贯性是保证正常认知功能的关键。BDNF是突触形成、改建和信息传递过程中重要的调节因子，可保证突触的可塑性，在促进神经细胞再生、分化、信号传递、突触可塑性等方面起着重要作用。本研究显示，ISO组在吸入ISO第1天海马组织中BDNF mRNA表达水平降低，提示其参与了认知功能障碍的发生过程[13,14]；在干预后第4、7天，BDNF mRNA均恢复至正常水平，同时大鼠的认知功能也恢复正常，提示BDNF mRNA表达上调可促进ISO所致认知障碍损伤的恢复。MMP-9可分解明胶、Ⅳ胶原和弹性蛋白等蛋白质类物质，参与细胞外基质降解和胶原合成过程；另外，其也属于炎性因子的一种，在炎症和恶性肿瘤的形成过程中起重要作用[15]。本研究结果显示，ISO组干预后第1天海马组织中MMP-9 mRNA表达水平上升。这说明ISO可上调MMP-9 mRNA的转录、合成水平，促进MMP-9的高表达；高水平状态的MMP-9通过降解细胞外基质，破坏毛细血管间紧密连接和基底膜，破坏血脑屏障，引起脑水肿，进一步加重神经认知功能障碍[16]。

综上所述，ISO吸入麻醉会对大鼠认知功能造成短暂性损害，导致学习记忆能力下降，其机制与大鼠海马组织中炎症因子及MMP-9基因表达升高、BDNF基因表达降低有关。本研究的创新之处，不仅确定了ISO对神经功能的影响，还从分子水平和基因水平解释了ISO影响神经功能机制，具有重要的意义。