人脐带间充质干细胞尾静脉注射移植对围绝经期大鼠血清LH和INHB水平的影响

毛邱娴，佘昊清，李嘉，尹春艳

(广东省第二人民医院,广州510317)

近年来有研究发现，围绝经期综合征的发病年龄有年轻化趋势，发病率也有所上升，成为影响中老年妇女生活质量的重要疾患之一。卵巢功能衰退是围绝经期综合征发生的重要原因，黄体生成素(LH)、抑制素B(INHB)是反映卵巢功能的重要性激素指标。近期研究发现，人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)移植对压力性尿失禁、子宫内膜疾病、卵巢早衰等妇科疾病的治疗有较好效果。2016年7～12月，我们将hUCMSCs移植入围绝经期SD大鼠体内后，检测移植前后大鼠血清LH、INHB水平变化，评估该细胞对围绝经期卵巢功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验对象 13～15月龄SD健康雌性大鼠40只，体质量410～450 g；3～6月龄SD健康雌性大鼠15只，体质量280～320 g；研究对象均由广东省动物实验中心提供，生产许可证号SCXK(粤)2009-0003,自然条件下喂养，食水自取。

1.2 实验方法

1.2.1 hUCMSCs的传代与扩增 hUCMSCs原代细胞购于重庆华雅干细胞技术有限公司，置于适宜的环境进行保存；对细胞进行冲洗、胰蛋白酶消化，用完全培养基进行消化终止。离心、去除上清后，用完全培养基重悬，以1∶3进行传代；当细胞总数达到2×107个(细胞保证7代内)，将细胞配成1×106/mL的单细胞悬液备用。

1.2.2 围绝经期大鼠的选取 40只13～15月龄SD大鼠编号后，于每日8:00行阴道周期涂片检测，显微镜下观察并记录动情周期[1]。将出现动情周期紊乱或动情周期时间延长，如持续动情期、持续动情间期、无动情周期的大鼠纳入围绝经期[2，3]。

1.2.3 动物分组及hUCMSCs移植 将动情周期紊乱的30只大鼠随机分为A、B组各15只，分别于尾静脉注射移植液PBS、hUCMSCs(1×106/mL) 1 mL,隔日1次，共2次。15只3～6月龄(青年期)SD健康雌性大鼠(C组)作为对照，不予任何处理。

1.2.4 血清LH、IHNB检测 在成模时(移植前)及移植后2、3、4周时，分别于各组大鼠眼眶内眦静脉采血2 mL，放入4 ℃离心机(1 000 r/min×15 min)离心，将血清吸出移入EP管，-80 ℃冰箱保存备用；采用ELISA法检测血清LH、INHB，操作流程按照说明书进行。

2 结果

2.1 各组血清LH水平比较 见表1。

表1 各组血清LH水平比较

注：与同组移植前比较，aP<0.05；与C组同时点比较，bP<0.05；与A组同时点比较，cP<0.05。

2.2 各组血清INHB水平比较 见表2。

表2 各组血清INHB水平比较

注：与同组移植前比较，aP<0.05；与C组同时点比较，bP<0.05；与A组同时点比较，cP<0.05。

3 讨论

干细胞移植在现代临床治疗手段当中具有重要价值，对器官的衰老、不可逆损伤、难治性疾病有重要影响[4]。近几年来，hUCMSCs因具有细胞易获得，感染率、免疫原性低，培养方便，无伦理限制等优势，在各治疗手段当中备受关注。

间充质干细胞(MSCs)于1966年在骨髓中被发现，此细胞在特殊条件下可分化为肌腱、韧带等细胞，其自我更新、增殖、多项分化潜能已得到认可[5]。hUCMSCs同样具有定向分化潜能，且“可塑性”不亚于骨髓MSCs，同样可定向分化为体内多种细胞[6]。在生物学特性上，hUCMSCs主要以贴壁生长为主，原代培养72 h后常呈成纤维细胞形态，胞质丰富，核大，3～4 d可进行传代，传代至20代后仍可维持细胞原有形态[7]。付霞霏等[8]将自身免疫性卵巢早衰小鼠移植hUCMSCs后，移植组早衰小鼠体内雌激素高于对照组、卵泡刺激素(FSH)低于对照组，镜下卵巢组织也有所改善，认为hUCMSCs可有效改善早衰小鼠卵巢功能。在俞凌[9]的研究中，将hUCMSCs移植入雌性卵巢早衰小鼠体内，移植后小鼠卵巢内卵泡数目及质量均有效提高，细胞凋亡数目明显减少。Sun等[10]建立了环磷酰胺诱导的卵巢早衰大鼠模型，移植hUCMSCs能增加激素分泌和卵泡发生，并减少卵巢细胞凋亡。这些研究表明hUCMSCs在卵巢早衰治疗中有效，该结论也得到其他研究者的支持[11]。

卵巢周期性排卵的改变是女性生殖内分泌的特征。LH刺激体内雌激素分泌，促进卵泡成熟和排卵。临床研究中，女性卵巢功能逐渐衰退，储备功能下降，体内雌激素分泌量减少，导致LH水平升高；高水平LH可刺激卵泡分泌雌激素，使女性内分泌的激素变化有效循环。若雌激素仍处于低水平状态，垂体负反馈减少，可进一步升高LH；随着时间的推移，卵巢周期性激素变化失衡，卵泡发育逐渐抑制，最终进入绝经期[12]。

本实验采用正常衰老大鼠作为模型，再现卵巢衰老状态。结果发现,A、B组成模时围绝经期大鼠血清LH水平均高于C组，A、B组间移植前差异无统计学意义，表明围绝经期大鼠体内LH处于较高表达状态。于移植后2、3、4周再次检测LH，A组随时间推移较移植前均有升高，表明A组卵巢功能进一步进入衰老；B组移植后2周血清LH水平低于A组，提示在hUCMSCs移植后2周就能改善卵巢分泌LH水平。胡佳佳等[13]研究发现，hUCMSCs移植围绝经期大鼠2周后电镜下卵巢结构改善，本研究结果与之相符，提示hUCMSCs可延缓围绝经期大鼠卵巢衰老。移植后3、4周，B组血清LH水平仍低于同时点A组，表明hUCMSCs移植3、4周后仍有改善卵巢功能的效果。B组移植后2、3、4周仍高于同时点C组，表明hUCMSCs虽能有效缓解卵巢的衰老，但能否使其卵巢功能恢复到青年期大鼠水平，仍需进一步验证。

近年来，INHB在临床中对预测女性卵巢储备功能有着越来越重要的位置。该蛋白对FSH有调节作用，在卵巢储备功能减退时该蛋白能早于FSH发生变化。因此，有学者认为将血清INHB水平作为预测卵巢储备功能的直接指标[14]。Zhang等[15]以卵巢早衰大鼠为研究对象，将hUCMSCs经静脉注射或植入卵巢后第14、30天，大鼠卵巢内卵泡数目、激素水平有明显提高。我们前期研究中发现，将自然衰老的围绝经期大鼠体内移植hUCMSCs，第14天血清AMH、INHB水平较给予PBS大鼠升高，表明hUCMSCs可改善自然衰老的围绝经期大鼠卵巢储备功能[15]。本研究结果显示，实验成模时A、B组围绝经期大鼠体内INHB激素水平均低于C组，两组间差异无统计学意义；在移植后2、3、4周A组血清INHB水平较移植前降低，表明随时间推移其卵巢功能逐渐衰老。而B组在移植后2、3、4周血清INHB水平均较移植前升高，且高于同时点A组水平。这提示hUCMSCs能有效改善大鼠卵巢功能，且持续至4周仍然有效，与胡佳佳等[13]研究结果相似。B组移植后2、3、4周血清INHB水平仍低于同时点C组，再次表明hUCMSCs虽能有效缓解卵巢的衰老，但未能使其卵巢功能恢复到青年期大鼠水平。有研究发现，将干细胞移植入化疗导致的卵巢早衰小鼠体内，能使其恢复卵巢功能且完成生育。但是，hUCMSCs能否使围绝经期大鼠恢复至青年时期水平，仍需更多实验加以证明。

综上所述，本研究发现，hUCMSCs移植入围绝经期大鼠体内后，能有效降低LH水平、提高INHB水平，在移植后2～4周均有效果；而未移植大鼠随时间推移，其卵巢功能逐渐走向衰老。因此，我们认为hUCMSCs移植可改善围绝经期大鼠的卵巢功能，提高了其卵巢的贮备能力，虽不能使其卵巢功能达到青年期大鼠卵巢水平，但能有效延缓卵巢功能衰老。与青年期大鼠激素水平的差距是否与注射次数及注射剂量有关，仍需我们今后进一步加以验证。