同型半胱氨酸通过YAP 通路调控大鼠冠状动脉血管平滑肌细胞高反应性的作用机制研究

陈玉龙，万招飞，刘小军，范佳丽，薛嘉虹，王新宏

冠状动脉痉挛指冠状动脉骤然强烈收缩引起血管闭塞或接近闭塞，导致心肌缺血，进而引发冠状动脉痉挛型心绞痛、心肌梗死或猝死等严重心血管事件，目前其发病率较高［1］。冠状动脉痉挛常突然发病，不易预测［2］，目前研究认为冠状动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）高反应性是其发生的关键［3］。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代谢过程中产生的含硫非必需氨基酸，高Hcy（血Hcy ≥15 μmol）是冠状动脉粥样硬化性心脏病的独立危险因素。既往研究表明，高Hcy 可作为冠状动脉痉挛型心绞痛的生物学标志物之一［4］；另外，高Hcy 还能诱导小鼠冠状动脉痉挛［5］。但Hcy 引发冠状动脉痉挛的具体机制尚不清楚。YAP 是一种调控细胞增殖、分化及凋亡的转录共激活子，由YAP1 基因表达，是Hippo信号通路下游的主要效应子，因此其表达水平和功能受Hippo 信号通路调控。Hippo 信号通路被抑制，YAP 从胞质转入胞核并结合转录增强子，促进基因转录，进而调控多种生物学功能［6］。既往研究表明，YAP 激活可导致肺动脉高压［7］。但YAP 在冠状动脉VSMC 高反应性中扮演何种角色及相关机制尚不明确。本研究旨在探讨Hcy 通过YAP 通路调控大鼠冠状动脉VSMC 高反应性的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2018 年1—10 月，雄性SD 大鼠均购自西安交通大学实验动物中心，体质量300～350 g，在清洁级动物房单笼饲养，自由摄食饮水，保持大鼠生活环境通风及清洁卫生，温度为（24±1）℃，相对湿度为40%～60%，12 h 光照/黑暗交替。本次动物实验步骤经西安交通大学医学部伦理委员会审核批准。

1.2 主要仪器及试剂 DMT620 微血管张力测定仪（丹麦DMT 公司生产）、CO2细胞培养箱（美国Thermo公司生产）、电泳仪（美国Bio-Rad 公司生产）、ChemiDoc XRS 化学发光成像系统（美国Bio-Rad 公司生产）；DL-Hcy、内皮素1（ET-1）、内皮素B 型受体激动剂蛇毒类似物（sarafotoxin 6c，S6c）、YAP1抑制剂维替泊芬（verteporfin，VP）购自美国Sigma-Aldrich 公司；抗β-actin、内皮素A 型（ETA）受体、内 皮 素B 型（ETB） 受 体、YAP、ERK1/2、mTOR、AMPK、磷 酸 化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷 酸 化mTOR（p-mTOR）、磷酸化AMPK（p-AMPK）抗体及抗Sirt1抗体均购自美国Abcam 公司或美国Cell Signaling 公司。

1.3 离体血管环制备及培养 对SD 大鼠实施安乐死后在无菌环境中迅速去除心脏，置于4 ℃标准钠盐缓冲液（NaCl 119 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，NaHCO315 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L）中，缓慢挤压出心脏残留血液。在体视显微镜下分离出间隔支、对角支和前降支，置于4 ℃标准钠盐缓冲液中，细金属丝（40 μm）穿入血管腔去除内皮，剥离外膜组织，将血管横切成长1.0～1.5 mm 的血管环。将新鲜的冠状动脉血管环作为A 组；在37 ℃、5%CO2条件下，将在含青霉素（100 U/L）和链霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培养基中培养的冠状动脉血管环作为B 组，将在Hcy（200 μmol/L）+含青霉素（100 U/L）和链霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培养基中培养的冠状动脉血管环作为C 组，将在VP（1 nmol/L）+含青霉素（100 U/L）和链霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培养基中培养的冠状动脉血管环作为D组，将在Hcy（200 μmol/L）+VP（1 nmol/L）+含青霉素（100 U/L）和链霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培养基中培养的冠状动脉血管环作为E 组；除A 组外冠状动脉血管环均培养24 h。

1.4 血管收缩张力测定 在新鲜或培养24 h 的冠状动脉血管环（去除内皮）内穿两根微细钢丝，其中一端连接myograph system 传感器，另一端连接微调装置，接入PowerLab 系统持续记录血管收缩张力。每个血管环给予2 mN 的预张力后稳定1.0～1.5 h，期间每15 min 更换1 次恒温（37 ℃）的标准钠盐缓冲液，血管环稳定后采用高钾缓冲液（K＋60 mmol/L）检验血管收缩活性两次并计算平均值，将平均值作为ETA受体或ETB受体激动剂收缩强度的参照标准，高钾缓冲液引起的血管收缩张力＞1.0 mN 的血管环可用于正式实验。S6c 使用前先采用标准钠盐缓冲液稀释成浓度梯度，以浓度累加法将药物由最低浓度依次加入浴槽，数秒内引起血管收缩，当收缩曲线达到最高不再继续上升时即加入下一浓度的药物，所测累积浓度-反应曲线即代表ETB受体诱导的血管收缩情况。待血管张力恢复基线后（提示ETB受体已完全消耗分解）以同样的方法加入ET-1，所测累积浓度-反应曲线即代表ETA受体诱导的血管收缩情况。S6c 和ET-1 诱导的血管压力变化以60 mmol/L K+诱导的血管收缩百分比表示。

1.5 Western blot法 采用Western blot法检测ETA受体、ETB受体、YAP 及ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、Sirt1 表达水平，具体如下:采用细胞裂解液裂解离体培养血管环，4 ℃环境下12 000×g离心20 min，取上清液，严格按照Pierce BCA 蛋白定量试剂盒说明书操作步骤检测蛋白表达，蛋白变性后SDS-PAGE 凝胶电泳后转PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭1 h 后加入适当浓度的一抗，将膜在4 ℃环境下孵育过夜，洗脱后加入适当浓度的二抗，置于37 ℃环境下孵育60 min，显色后利用ChemiDoc XRS 化学发光成像系统采集图像，Quality One 软件分析目标条带灰度值，并与内参β-actin 比较。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据处理，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hcy 上调冠状动脉VSMC 的ETA受体、ETB受体、YAP 表达及其受体介导的血管收缩 Hcy 可增强S6c 和ET-1呈浓度依赖方式介导的冠状动脉血管收缩，见图1。A、B、C 组冠状动脉血管环的ETA受体/β-actin、ETB受体/β-actin 及YAP/β-actin 比较，差异有统计学意义（F 值分别为5.516、30.028、40.494，P 值分别为0.044、0.001、＜0.01）；C组冠状动脉血管环的ETA受体/β-actin、ETB受体/β-actin 及YAP/β-actin 高于A 组和B 组，B组冠状动脉血管环的ETB受体/β-actin 及YAP/β-actin高于A 组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图2～3）。2.2 VP 抑制由Hcy 上调冠状动脉VSMC 的ETA受体、ETB受体、YAP 表达及其受体介导的血管收缩 VP 能有效抑制由Hcy 上调的S6c 和ET-1 呈浓度依赖方式介导的冠状动脉血管收缩，见图4。B、C、D、E 组大鼠冠状动脉血管环ETA受体/β-actin、ETB受体/β-actin及YAP/β-actin 比较，差异有统计学意义（F 值分别为17.593、109.180、149.356，P 均＜0.01）；C 组大鼠冠状动脉血管环ETA受体/β-actin、ETB受体/β-actin及YAP/β-actin 高于B、D、E 组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图5～6）。

图1 A、B、C 组S6c、ET-1 诱导的冠状动脉血管环收缩的累积浓度-反应曲线Figure 1 Cumulative concentration-reaction curve for vasoconstriction of coronary artery mediated by S6c and ET-1 in groups A，B and C

图2 A、B、C 组冠状动脉血管环ETA 受体、ETB 受体及YAP 电泳结果Figure 2 Electrophoretic results of ETA receptor，ETB receptor and YAP of coronary vascular ring in groups A，B and C

图3 A、B、C 组冠状动脉血管环ETA 受体/β-actin、ETB 受体/β-actin 及YAP/β-actin 比较的条形图Figure 3 Bar charts for comparison of ETA receptor/β-actin，ETB receptor/β-actin and YAP/β-actin of coronary vascular ring in groups A，B and C

2.3 Hcy 上调冠状动脉VSMC p-ERK1/2和p-mTOR 表达 B、C、D、E 组冠状动脉血管环p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 比较，差异有统计学意义（F 值分别为37.903、15.229、24.202、46.071，P 均＜0.01）；C 组冠状动脉血管环p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR 高 于B、D、E 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B 组冠状动脉血管环p-ERK1/2/ERK1/2高 于D 组，p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 高于C、D、E 组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图7～8）。

3 讨论

图4 B、C、D、E组S6c、ET-1诱导的冠状动脉血管环收缩的累积浓度-反应曲线Figure 4 Cumulative concentration-reaction curve for vasoconstriction of coronary artery mediated by S6c and ET-1 in groups B，C，D and E

图5 B、C、D、E 组冠状动脉血管环ETA 受体、ETB 受体及YAP 电泳结果Figure 5 Electrophoretic results of ETA receptor，ETB receptor and YAP of coronary vascular ring in groups B，C，D and E

ET-1 是一种有效的血管收缩因子，能诱导血管持续且强烈地收缩，其与受体结合后可发挥生物学功能。 ET-1 的受体主要包括ETA受体和ETB受体，正常生理状态下ETA受体表达于VSMC，可介导血管收缩；而ETB受体则表达于血管内皮细胞，可通过释放一氧化氮和前列腺环素而介导血管舒张。病理状态下，ETB受体仅表达于VSMC 且呈高表达状态，介导血管强烈收缩，增强VSMC 对ET-1 的高反应性［8］。既往研究表明，心脏缺血再灌注能诱导冠状动脉VSMC 高表达ETB受体［9］。另外，一些心血管危险因素如吸烟［10］、微氧化的低密度脂蛋白［11］和大气细颗粒物（PM2.5）［12］等均能上调冠状动脉VSMC 的ETA和ETB受体表达，进而增强血管平滑肌收缩的敏感性，提示冠状动脉VSMC 高反应性在冠状动脉痉挛过程中具有关键作用，而上调内皮素受体表达可能是冠状动脉VSMC 高反应性的关键原因之一。本研究结果显示，Hcy 可增强S6c 和ET-1 呈浓度依赖方式介导的冠状动脉血管收缩，且C 组冠状动脉血管环的ETA受体/β-actin、ETB受体/β-actin 高于A 组和B 组，B 组冠状动脉血管环的ETB受体/β-actin高于A 组，提示Hcy 通过上调内皮素受体而增强冠状动脉VSMC 高反应性。

图6 B、C、D、E 组冠状动脉血管环ETA 受体/β-actin、ETB 受体/β-actin 及YAP/β-actin 比较的条形图Figure 6 Bar charts for comparison of ETA receptor/β-actin，ETB receptor/β-actin and YAP/β-actin of coronary vascular ring in groups B，C，D and E

图7 B、C、D、E 组冠状动脉血管环p-ERK1/2、ERK1/2、p-mTOR、mTOR、p-AMPK、AMPK 及Shirt1 电泳结果Figure 7 Electrophoretic results of p-ERK1/2，ERK1/2，p-mTOR，mTOR，p-AMPK，AMPK and Shirt1 of coronary vascular ring in groups B，C，D and E

既往研究表明，YAP 是关键的血管生成调节因子［13-14］，其激活能促进肺动脉高压发生［7］。但目前YAP 与冠状动脉VSMC 高反应性的关系尚不清楚。本研究结果显示，C 组冠状动脉血管环的YAP/β-actin 高于A 组和B 组，B 组冠状动脉血管环的YAP/β-actin高于A 组，提示Hcy 能上调冠状动脉VSMC 的YAP 表达。为了进一步明确YAP 在Hcy 调控冠状动脉VSMC内皮素受体中的作用，本研究通过阻断YAP 而观察Hcy 对大鼠冠状动脉VSMC 内皮素受体表达及其受体血管收缩的影响，结果发现YAP 抑制剂VP 能有效抑制Hcy 上调的冠状动脉VSMC 的ETA和ETB受体及其受体介导的血管收缩。前期研究发现，Hcy 或高糖可通过ERK1/2、Sirt1、AMPK、mTOR 信号通路介导调控VSMC内皮素受体［15-17］，那么YAP 能否通过以上通路影响Hcy 对冠状动脉VSMC 内皮素受体的调控？本研究结果显示，C 组冠状动脉血管环p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR 高于B、D、E 组；B 组冠状动脉血管环p-ERK1/2/ERK1/2高 于D 组，p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 高于C、D、E 组，提示YAP 抑制剂仅能抑制由Hcy 上调的ERK1/2、mTOR 磷酸化表达，但对Hcy 下调的AMPK磷酸化和Sirt1 表达无影响，提示ERK1/2和mTOR 信号通路可能参与YAP 对内皮素受体的调控。

综上所述，Hcy 可能通过YAP 通路激活ERK1/2和mTOR 信号通路，上调VSMC 内皮素受体，进而增强冠状动脉VSMC 高反应性，这将为高Hcy 致冠状动脉痉挛的具体作用机制研究提供新的理论依据，也为高Hcy 所致缺血性心血管疾病的诊断和临床研究提供新的线索。

作者贡献：陈玉龙进行文章的构思与设计；万招飞进行研究的实施与可行性分析；刘小军进行数据收集、整理、分析；范佳丽进行结果分析与解释；王新宏负责撰写论文，对文章整体负责，监督管理；薛嘉虹进行论文的修订，负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。

图8 B、C、D、E 组冠状动脉血管环p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 比较的条形图Figure 8 Bar charts for comparison of p-ERK1/2/ERK1/2，p-mTOR/mTOR，p-AMPK/AMPK and Shirt1/β-actin of coronary vascular ring in groups B，C，D and E