黄连素对人卵巢癌SKOV3细胞内质网应激-自噬途径的调节作用*

2019-10-24 11:17:14李松岩刘师兵崔万丽
中国病理生理杂志 2019年10期
关键词:黄连素内质网显微镜

李松岩, 于 洋, 刘师兵, 崔万丽, 徐 路, 孙 奇, 徐 冶△

(吉林医药学院 1基础医学院, 2科研实验室, 吉林 吉林 132013)

卵巢癌是全世界较为严重的妇科肿瘤之一,其发病率位居第7位,仅次于宫颈癌和子宫体癌[1-2]。长期以来缺少有效的治疗药物,治疗后容易出现化疗药物耐药,使卵巢癌的治疗及预后效果不理想[3]。黄连素(berberine,Ber)是从黄连、黄柏和三颗针等植物中提取的一种生物碱,又称小檗碱[4-6],具有显著的抗菌、抗心律失常、降血压和调节血脂等作用[7]。研究表明,黄连素还具有较强的抗肿瘤作用[8-10]。然而,黄连素对肿瘤的作用机制尚不清楚。本研究通过黄连素作用人卵巢癌SKOV3细胞,探究黄连素对SKOV3细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)及自噬的作用。

材 料 和 方 法

1 材料和主要试剂

人卵巢癌SKOV3细胞购自上海中国科学院细胞库。黄连素和MTT购自Sigma;抗beclin-1、泛素结合蛋白p62、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP)抗体均购自Santa Cruz;新生胎牛血清和DMEM培养基购自Gibco;抗微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)抗体购自Abcam;相应II抗购自长春德尔塔公司;Hoechst 33342荧光染料等购于北京鼎国公司;PVDF膜购自Milipore。

2 方法

2.1细胞培养和分组处理 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,加入青霉素(1×105U/L)和链霉素(100 mg/L),于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期且生长状态良好的细胞进行实验。将细胞密度调整为8×106/L,每孔20 μL接种于96孔板,随机分为正常对照组和黄连素12.5、25、50、100、200和400 μmol/L组,分别处理12 h、24 h和48 h后进行指标检测。

2.2MTT方法检测细胞活力 取2.1分组处理的细胞,每孔加入新配制MTT 200 μL,在细胞培养箱中37 ℃孵育4 h,弃去孔中培养液,每孔加入DMSO 150 μL,并震荡10 min,Model-680型酶标仪于490 nm波长测定吸光度(A490)。测3次,取平均值。细胞活力抑制率(%)=1-(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

2.3倒置显微镜下观察细胞形态 细胞以1×108/L的密度接种于24孔板中,每孔500 μL,并置于细胞培养箱中培养过夜。细胞长至80%密度后,随机分为正常对照组、黄连素(50 μmol/L)组、黄连素(100 μmol/L)组和黄连素(200 μmol/L)组,继续培养24 h。在倒置相差显微镜下观察各组细胞收缩、细胞密度情况,并记录、照相。

2.4Western blot法检测beclin-1、LC3、CHOP和GRP78的蛋白表达 将细胞随机分为正常对照组、黄连素50 μmol/L组、黄连素100 μmol/L组和黄连素200 μmol/L组,培养24 h后,去掉细胞培养液,用胰酶进行消化,收集细胞,加入150 μL RIPA蛋白裂解液,超声2次,每次3~5 s,4 ℃放置30 min,高速台式冷冻离心机离心,并收集上清液。用BCA法进行蛋白定量。将SDS-PAGE结束后的蛋白转移到PVDF膜上,用5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h,PBST洗3次,加入相应的I抗,4 ℃过夜。次日用PBST洗3次,加入相应的含有HRP标记的II抗,室温孵育1.5 h;PBST洗5次,用ECL显色液孵育,扫描纪录。以β肌动蛋白作为内参照,采用Quantity One软件进行分析处理,以目标蛋白与内参照的吸光度比值表示蛋白的相对表达量。

2.5间接免疫荧光法检测p62和LC3的表达 高压消毒后用无菌盖玻片置于24孔板,取对数生长期细胞,调整细胞密度为1.0×107/L, 每孔500 μL接种过夜。次日待细胞生长至80%融合,药物作用细胞24 h后,弃培养基,加入200 μL 4%多聚甲醛,作用。蛋白酶K消化1 min后,PBS洗涤3次,再用0.1% Triton-PBS作用5 min,PBS洗涤3次。加入5%非免疫动物血清作用30 min,加入相应Ⅰ抗(1∶200),4 ℃过夜,次日加入相应Ⅱ抗,Hoechst 33342染色5 min,PBS洗涤3次,甘油封片,激光共聚焦显微镜下观察取图。

3 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析处理,所有数据以均数±标准差(mean±SD)表示,实验均重复3次,组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析,两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MTT法检测SKOV3细胞活力

MTT实验结果显示,黄连素(12.5、25、50、100、200和400 μmol/L)对SKOV3细胞的活力具有明显的抑制作用,且呈现浓度依赖性(r=0.973,P<0.05);随着黄连素作用时间的延长,对SKOV3细胞活力的抑制作用也逐渐增强,呈现时间依赖性(r=0.984,P<0.05),见图1。作用12 h,黄连素的IC50为(764.7±0.3)μmol/L;作用24 h,黄连素的IC50为(231.6±0.1)μmol/L;作用48 h,黄连素的IC50为(96.2±0.1)μmol/L。这些结果表示黄连素可显著抑制SKOV3细胞的活力。

Figure 1. The effect of berberine (Ber) on the viability of human ovarian cancer SKOV3 cells measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1 MTT法检测黄连素对SKOV3细胞活力的影响

2 黄连素对SKOV3细胞形态的影响

倒置相差显微镜观察结果显示,黄连素200 μmol/L可明显抑制SKOV3细胞的生长,导致细胞收缩变圆,细胞密度稀薄,见图2。

Figure 2. The effect of berberine on the morphological changes of SKOV3 cells (×250).

图2 黄连素对SKOV3细胞形态的影响

3 间接免疫荧光法检测自噬标志蛋白p62和LC3的共定位

激光共聚焦显微镜检测结果显示,与正常对照组相比,黄连素作用24 h后,可见LC3(FITC标记)与p62(rhodamine标记)蛋白散在分布,且荧光强度增加的同时呈现点状聚集,在黄连素(200 μmol/L)组可见明显增强,且有明显的共定位现象,见图3。

4 黄连素对SKOV3细胞p62、beclin-1、CHOP、LC3和GRP78蛋白表达的影响

Western blot法检测结果显示,与空白对照组相比,随着黄连素药物浓度的增加,内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP表达显著上升(P<0.05或P<0.01)。

Figure 3. The effect of berberine (Bear) on p62 and LC3 protein co-localization in SKOV3 cells (confocal laser scanning microscopy,×800).

图3 共聚焦显微镜观察黄连素对SKOV3细胞LC3和p62蛋白共定位的影响

与空白对照组相比,随着黄连素药物浓度的增加,自噬相关蛋白p62、beclin-1和LC3表达显著升高(P<0.05或P<0.01),见图4。

Figure 4. The effect of berberine (Ber) on the protein expression of beclin-1, LC3, p62, CHOP and GRP78 in the SKOV3 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图4 Western blot法检测SKOV3细胞中相关蛋白的表达

讨 论

卵巢癌作为一种常见的女性恶性肿瘤,在临床治疗中常常面临着化疗药物耐药的重大难题。研究表明,产生化疗药物耐药的原因可能与ERS引起的自噬和凋亡有着密切的关系[11]。目前,寻找到新的抗肿瘤药物成为首要任务。黄连素是从中药黄连中提取出的一种异喹啉生物碱,其价格低廉,不良反应小。现代研究表明,黄连素具有抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物、调节脂代谢和免疫抑制等作用[3-4, 6, 8]。本研究结果表明,黄连素作用于人卵巢癌SKOV3细胞后,细胞活力下降,细胞收缩变圆,细胞密度也明显下降,存在时间和剂量依赖性,这与已报道结果一致[11]。

内质网是细胞行驶正常功能的重要组成部分,内质网内腔是一个独立的细胞环境。当错误折叠与未折叠蛋白聚集、钙离子平衡紊乱时[12],内质网会发生应激反应,即内质网应激。研究表明,黄连素可以通过调节内质网应激水平,来调节细胞凋亡和炎症的发生、氧化应激及能量代谢等[4,6-7, 9, 12]。自噬是调控细胞死亡及细胞功能的利刃,具有双面性,细胞的自噬现象常常伴随着凋亡同时出现[13]。在不同的细胞中,内质网应激和自噬之间有着复杂的调控关系[14]。研究表明,黄连素是较好的自噬激活剂,其可以通过调节自噬改变线粒体动力学,影响细胞的能量摄取和物质代谢,并导致细胞凋亡[15]。然而,黄连素与肿瘤细胞内质网应激及自噬调节之间的分子机制尚待进一步研究。

本研究表明,随着黄连素药物浓度的增加,SKOV3细胞的活力逐渐降低。激光共聚焦显微镜结果显示,随着黄连素药物浓度的增加,SKOV3细胞中LC3和p62蛋白表达逐渐增强。内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP及自噬相关蛋白beclin-1和LC3的表达显著增强。结果表明,黄连素可以诱导SKOV3细胞产生内质网应激及自噬。本研究为卵巢癌的治疗提供理论依据,并为中药治疗卵巢癌策略提供新线索。黄连素是否可用来治疗卵巢癌还需进一步的研究。

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