miR-137通过TWIST1调控乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭、迁移及凋亡*

马 琛， 彭 力△， 陈 静， 叶佳颖

(1重庆市第四人民医院病理科， 重庆 400014； 2浙江卓运生物科技有限公司， 浙江 宁波 315174)

乳腺癌是常见的恶性肿瘤，至今没有较好的治疗方法，随着分子遗传学的不断发展，基因治疗已经成为乳腺癌研究的重要内容[1]。乳腺癌的发生与多种微小RNA(microRNA，miRNA，miR)的异常表达有关，这些miRNAs在乳腺癌组织中异常表达并且参与调控细胞的凋亡和侵袭等过程[2]。miR-137在正常脑组织、海马组织等组织中表达，与神经分化和精神分裂等有关[3]。目前的研究显示，miR-137参与肿瘤进展，其在胶质瘤、结直肠癌、宫颈癌等肿瘤进展中均发挥抑制作用，对于肿瘤细胞的侵袭和迁移能力有抵抗作用[4-6]。miR-137在乳腺癌中低表达，并且可能参与乳腺癌的侵袭过程，过表达miR-137可以抑制成年小鼠肿瘤形成能力[7]。目前对于miR-137在乳腺癌细胞中的作用和机制研究尚不明确。我们的实验以乳腺癌MDA-MB-231细胞为体外研究对象，探讨miR-137在乳腺癌细胞凋亡、侵袭、迁移中的作用和靶向调控机制。

材 料 和 方 法

1 材料

抗TWIST1抗体和抗基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology；抗cleaved caspase-3(C-caspase-3)抗体和抗Bax抗体购自BioVision；Lipofectamine 2000购自Invitrogen；miR-137 mimics和mimics control由上海吉玛制药技术有限公司构建合成；TWIST1过表达载体(pcDNA3.1-TWIST1)由北京合生基因科技有限公司构建；突变型(mutant,MUT)萤光素报告载体和野生型(wild type, WT)萤光素酶报告载体由武汉金开瑞生物工程有限公司构建；MicroRNA Reverse Transcription Kit购自上海慧颖生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa；BCA蛋白定量检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；ECL化学发光检测试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司。乳腺癌MDA-MB-231细胞购自中国医学科学院肿瘤细胞库。

2 方法

2.1细胞转染 MDA-MB-231细胞的生长密度为60%时进行细胞转染。取EP管，以不含血清和双抗的DMEM与Lipofectamine 2000混合，记为溶液A；另取EP管，将不含血清和双抗的DMEM与miR-137 mimics和mimics control分别混合，记为溶液B。将上述混合溶液置于室温中孵育5 min后再混合；30 min后，添加到细胞中，培养6 h，更换新鲜的细胞培养液继续培养。将转染miR-137 mimics和mimics control的MDA-MB-231细胞分别设置为miR-137组和miR-NC组，设置不做转染处理的MDA-MB-231细胞为对照(control)组。

2.2RT-qPCR检测miR-137表达的变化 取转染48 h后的各组细胞，提取RNA并用MicroRNA Reverse Transcription Kit合成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq进行实时定量PCR，内参照为U6，数据分析方法为2-ΔΔCt法，PCR条件为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40个循环。miR-137的正向引物序列为5’-GCGCTTATTGCTTAAGAATAC-3’，反向引物序列为5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6的正向引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物序列为5’-ACGCTTCACG-AATTTGCGTGTC-3’。引物均由南京金斯瑞合成。

2.3流式细胞术测定上调miR-137对细胞凋亡的影响 取转染48 h后的各组细胞经胰蛋白酶消化成单细胞，以PBS将细胞洗涤以后，每组收集1×106个细胞，将细胞悬浮于500 μL的结合缓冲液中，添加5 μL的PI及Annexin V-FITC溶液，上流式细胞仪检测凋亡。

2.4Transwell小室测定上调miR-137对细胞侵袭和迁移的影响 迁移实验取转染后的各组细胞，将细胞密度调整为5×109/L(用不含血清的培养液悬浮)，在Transwell小室的上室内加入100 μL细胞悬浮液，在下室内添加含有胎牛血清的细胞培养液500 μL，48 h后取出小室，用PBS洗涤2次以后，将小室上室内的液体用棉签擦掉，添加4%多聚甲醛溶液孵育15 min后，再添加0.1%的结晶紫染色15 min。随机选取5个视野计数穿膜细胞数目即为迁移数目。细胞侵袭实验前将Matrigel添加到小室上室，在37 ℃孵育30 min，其余步骤同迁移实验。

2.5Western blot检测上调miR-137对细胞中MMP-9、C-caspase-3和Bax蛋白水平及TWIST1蛋白表达的影响 取转染48 h后的各组细胞，经胰蛋白酶消化后收集细胞，添加细胞裂解试剂(蛋白酶抑制剂∶细胞裂解液比例为1∶100)，置于冰上反应25 min后，离心，吸取上清溶液保存在-80 ℃。蛋白上清以BCA法定量检测，步骤参照试剂盒说明书。以10%的分离胶、5%的浓缩胶进行SDS-PAGE，电泳前将蛋白与等量体积的loading buffer混合后煮沸5 min变性。每孔蛋白上样量为50 μg，设置电泳电压为恒压80 V，观察溴酚蓝进入到玻璃板的底部边缘后终止电泳。把PVDF膜剪成同转印的蛋白胶同样大小，设置400 mA恒流转膜1.5 h。把PVDF膜浸泡于5%脱脂奶粉中室温孵育1 h，再把PVDF膜浸泡于1∶600稀释的I抗(MMP-9，C-caspase-3 和Bax)反应液中孵育2 h，最后把PVDF膜放在1∶5 000稀释的 II 抗反应液中反应2 h，取出PVDF膜，加ECL液化学发光，扫描分析条带的灰度值。目的蛋白表达水平=目的蛋白灰度值/内参照β-actin灰度值。取转染48 h后的各组细胞，以Western blot方法测定TWIST1蛋白表达水平，步骤同上，TWIST1抗体稀释倍数为1∶400，检测上调miR-137对TWIST1蛋白表达的影响。

2.6靶基因预测及萤光素酶报告系统鉴定 用生物信息学软件TargetScan预测到miR-137与TWIST1的3’-UTR端有结合位点，将TWIST1的3’-UTR端互补结合位点突变，构建MUT萤光素报告载体，同时构建野生型WT荧光素报告载体，荧光素酶报告载体为pMIR-PEPORT。将MUT和WT分别与miR-137 mimics、mimics control用Lipofectamine 2000共转染至乳腺癌细胞中，培养48 h后，用萤光素酶活性测定试剂盒检测萤光素酶活性变化。

2.7TWIST1过表达载体对上调miR-137后的乳腺癌细胞凋亡、侵袭及迁移的影响 取乳腺癌细胞，用Lipofectamine 2000将miR-137 mimics分别与TWIST1过表达载体(pcDNA3.1-TWIST1)和阴性对照载体(pcDNA3.1)共转染至细胞中，记为miR-137+TWIST1组和miR-137+vector组，转染后48 h，以Western blot检测TWIST1、MMP-9、C-caspase-3和Bax的蛋白水平，流式细胞术测定细胞凋亡，Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力，步骤均同上。

3 统计学处理

采用SPSS 21.0软件分析所有实验数据，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，两组数据用独立样本t检验，多组差异比较用单因素方差分析，组间比较用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-137 mimics提高乳腺癌MDA-MB-231细胞中miR-137的表达水平

MDA-MB-231细胞中转染miR-137 mimics后，细胞中的miR-137水平升高，见图1。

Figure 1. The expression of miR-137 in breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with miR-137 mimics. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

图1 各组乳腺癌MDA-MB-231细胞中miR-137的表达

2 上调miR-137可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭和迁移并诱导细胞凋亡

MDA-MB-231细胞中转染miR-137 mimics后，细胞凋亡率升高，细胞侵袭数目和迁移数目降低(P<0.05)，见图2。

3 上调miR-137可上调乳腺癌MDA-MB-231细胞中C-caspase-3和Bax的蛋白水平并抑制MMP-9的表达

MDA-MB-231细胞转染miR-137 mimics后，细胞中C-caspase-3和Bax蛋白水平升高，MMP-9蛋白水平降低(P<0.05)，见图3。

4 miR-137靶向调控TWIST1

生物信息学软件分析miR-137与TWIST1的3’-UTR端有互补结合位点，miR-137 mimics和WT共转染后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中萤光素酶活性降低(P<0.05)，见图4。

5 上调miR-137可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞中TWIST1蛋白的表达

MDA-MB-231细胞中转染miR-137 mimics后，细胞中TWIST1蛋白水平降低(P<0.05)，见图5。

6 过表达TWIST1可逆转miR-137 mimics对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭、迁移和凋亡的影响

MDA-MB-231细胞中共转染 TWIST1过表达载体和miR-137 mimics后，细胞中TWIST1蛋白水平升高，细胞凋亡率降低，细胞侵袭和迁移数目增多，细胞中C-caspase-3和Bax蛋白水平降低，MMP-9蛋白水平升高(P<0.05)，见图6。

讨 论

miR-137在海马齿状回颗粒细胞的下层高表达，对于神经元分化成熟、骨髓发育和树突发生等有重要意义，miR-137基因定位在1p21.3染色体上，其含有大量的CpG岛，miR-137表达水平的高低受到启动子甲基化影响[8]。miR-137参与了不同组织来源的恶性肿瘤进展，在胶质瘤和胰腺癌等肿瘤中均表达下降，miR-137可能参与肿瘤的进展和转移[4,9]。在胰腺癌细胞中上调miR-137表达可以降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，在宫颈癌细胞中上调miR-137能够诱导细胞凋亡，这些研究结果均表明，miR-137在肿瘤中可能发挥抑制作用[6,10-12]。既往的研究报道显示，miR-137表达上调可以抑制乳腺癌小鼠肿瘤生长，miR-137在乳腺癌中可能发挥抗癌作用[7]。本次实验证实了miR-137表达上调可以抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭、迁移并诱导凋亡，说明miR-137在体外乳腺癌细胞恶性表型中发挥抑制作用。

Figure 2. The effects of miR-137 mimics transfection on apoptosis (A), invasion and migration abilities (B) of the MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

图2 miR-137 mimics转染对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡率、侵袭数和迁移数的影响

Figure 3. Western blot was used to determine the protein levels of MMP-9, C-caspase-3 and Bax in the breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with miR-137 mimics. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

图3 Western blot检测miR-137 mimics转染后各组乳腺癌MDA-MB-231细胞中MMP-9、C-caspase-3和Bax蛋白水平的变化

Figure 4. miR-137 targeted regulation of TWIST1. A: bioinformatics software was used to analyze the 3’-UTR binding sites of miR-137 and TWIST1; B: luciferase activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

图4 miR-137靶向调控TWIST1

Figure 5. Western blot was used to determine the TWIST1 protein levels in the breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with miR-137 mimics. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

图5 Western blot检测miR-137 mimics转染后各组乳腺癌MDA-MB-231细胞中TWIST1的蛋白水平

肿瘤细胞的侵袭、迁移和凋亡等生物学特性的发挥与细胞内多种调控因子的复杂调控过程有关[13]。Caspase是一个与细胞凋亡有关的蛋白家族，其含有多个成员，其中caspase-3位于该凋亡反应的下游，也是细胞凋亡的执行因子[14]。Caspase-3在正常情况下没有活性，只有被激活后形成C-caspase-3才可以发挥促进凋亡的作用[15]。Bax是属于Bcl-2家族成员，在细胞凋亡中发挥促进作用[16]。MMP-9属于基质金属蛋白酶家族成员，其表达水平升高后是肿瘤侵袭和迁移能力升高的标志，MMP-9可以将细胞外基质降解，为肿瘤的转移提供条件[17]。我们的实验发现上调miR-137能够促进乳腺癌MDA-MB-231细胞中C-caspase-3和Bax蛋白表达，并抑制MMP-9蛋白表达，这与上述凋亡和侵袭、迁移结果一致，提示上调miR-137能够抑制乳腺癌细胞侵袭、迁移并诱导细胞凋亡。

miRNA发挥多种生物学作用与靶向调控基因的表达有关，其可以通过作用于靶基因的3’-UTR端而抑制其翻译过程[18]。目前对于miR-137的研究报道显示，其可以通过作用于多个靶基因发挥肿瘤抑制作用，如EGFR、SDC42和CDK6等[19-21]。我们的实验证实，miR-137可以通过抑制TWIST1的表达发挥抗乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭、迁移并诱导凋亡的作用，说明miR-137参与肿瘤发生过程与TWIST1表达有关。TWIST1在乳腺癌等肿瘤中高表达，其可以正调控肿瘤细胞侵袭、迁移，对于肿瘤的发生和发展具有促进作用[22]。

Figure 6. The changes of apoptosis (A), invasion, migration abilities (B) and the protein levels of MMP-9, C-caspase-3, Bax and TWIST1 (C) in the breast cancer MDA-MB-231cells after co-transfection of TWIST1 over-expression vector and miR-137 mimics. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-137+vector group.

图6 TWIST1过表达载体和miR-137 mimics共转染后乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、侵袭、迁移和MMP-9、C-caspase-3、Bax和TWIST1蛋白水平的变化

综上所述，miR-137具有抑制乳腺癌细胞恶性表型的作用，在乳腺癌中重建miR-137可能是乳腺癌治疗的途径之一，miR-137抗乳腺癌机制与靶向抑制TWIST1的表达有关，这为研究miR-137在肿瘤中的作用提供了参考。本次实验研究只在乳腺癌细胞MDA-MB-231中进行了初步探讨，在以后的实验中会继续研究其具体的靶向调控作用，并且会在多株乳腺癌细胞及体内进行验证。