miR-486调控PTEN影响LPS诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡的实验研究*

戴春威， 贾 珊， 陈 敏， 樊 琳， 何赛飞

(1庆阳市人民医院儿科， 甘肃 庆阳 745000; 2上海市中医药大学附属第七人民医院核医学科， 上海 200137)

肺泡上皮细胞是肺组织损伤发生时的靶细胞之一，其中肺泡Ⅱ型上皮细胞过度凋亡是肺损伤发生的重要原因[1]。内毒素是引起肺损伤发生的诱导因子，而脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是内毒素的主要成分，由LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡也是目前研究肺损伤发生机制的常见模型[2]。随着分子生物学的不断发展，微小RNA(microRNA,miRNA)在肺泡上皮细胞损伤中的作用受到广泛关注，肺泡上皮细胞中某些miRNA异常表达导致细胞特性异常，从而诱发肺组织功能缺失[3]。由于原代肺泡Ⅱ型上皮细胞对于微环境等要求极高，目前常用肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞作为研究对象[4]。miR-486是一个与细胞凋亡关系密切的miRNA分子，其在氧化应激条件下的肺泡上皮细胞中发挥保护作用，具有抗细胞凋亡的作用[5]。现阶段对于miR-486在LPS诱导的肺泡上皮细胞中的作用尚不清楚。本次实验以肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞作为体外实验对象，探讨miR-486在LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡中的作用和机制。

材 料 和 方 法

1 材料

肺泡Ⅱ型上皮细胞A549购自ATCC。LPS购自杭州联科生物技术股份有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；miR-486 mimics、mimics control、pcDNA 3.1-PTEN和pcDNA 3.1均由上海吉玛制药技术有限公司构建并合成；抗第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)抗体购自Abcam；抗cleaved caspase-3(C-caspase-3)抗体和C-caspase-9抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；MicroRNA Reverse Transcription Kit购自QIAGEN；萤光素酶报告载体由湖南普拉特泽生物科技有限公司构建。

2 方法

2.1RT-qPCR检测LPS诱导后肺泡上皮细胞中miR-486表达变化 肺泡上皮细胞用含150 mg/L LPS[2]的细胞培养液培养,记为LPS组，用不含LPS的细胞培养液培养记为对照(control)组，细胞培养24 h以后，用RT-qPCR检测细胞中miR-486的表达变化。RT-qPCR步骤为：利用TRIzol分别提取细胞中的总RNA，依照MicroRNA Reverse Transcription Kit进行反转录，利用SYBR Premix Ex Taq进行RT-qPCR，U6为内参照，反应结束以后根据每个反应的Ct值按照2-△△Ct方法分析miR-486表达变化。miR-486的上游引物序列为5’-ACACTCCAGCTGGGTCCTGTACTGACCTGCCC-3’，下游引物序列为5’-CTCAACTGGTCTCGTGGA-3’；U6的上游引物序列为 5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物为5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。PCR仪参数为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，共40个循环。

2.2细胞转染 用转染试剂Lipofectamine 2000分别把miR-486 mimics和mimics control转染到肺泡上皮细胞中，转染步骤完全按照转染试剂操作说明进行。细胞转染后，用含有150 mg/L LPS的细胞培养液培养24 h，分别记为miR-486+LPS组和miR-NC+LPS组，按照方法2.1中RT-qPCR方法测定细胞中miR-486的表达变化。

2.3流式细胞术测定细胞凋亡 取培养24 h以后的各组细胞，PBS洗涤后每组每个样品收集约1×106个细胞，把细胞悬浮在500 μL的Binding Buffer溶液中，继续添加5 μL的PI及Annexin V-FITC，孵育完毕立即用流式细胞仪测定各组细胞凋亡变化。

2.4Western blot检测细胞中C-caspase-3和C-caspase-9蛋白表达水平 在培养24 h以后的各组细胞中分别加入添加PMSF的RIPA蛋白提取试剂，均匀振混合以后，在冰上完全裂解，把裂解溶液转移到4℃中高速离心(12 000×g，离心10 min)，得到的上清溶液转移到EP管内，采用BCA法定量检测以后，进行SDS-PAGE。在电泳前将蛋白样品同上样缓冲液混合煮沸5 min，每个上样孔内添加30 μg蛋白样品。使用10%的分离胶进行电泳，采用恒压90 V电泳约3 h，观察染料进入到底部边缘以后终止电泳。转膜电流为250 mA恒流，转膜持续60 min。转膜后的PVDF膜放在提前配制的5%牛血清白蛋白封闭液中室温孵育1.5 h，再分别与I抗(4 ℃反应过夜)、II抗(37 ℃反应1 h)依次反应以后，按照常规ECL方法显色，用Image J软件分析条带的灰度值，β-actin作为内参照，对蛋白水平进行分析比较。

2.5靶基因预测及萤光素酶报告系统鉴定 利用靶基因预测软件预测PTEN可能是miR-486的靶基因，miR-486与PTEN的3，UTR端有互补结合位点，把PTEN的互补结合位点突变，构建突变型(MUT)萤光素酶报告载体，同时构建没有突变的野生型(WT)萤光素酶报告载体，用Lipofectamine 2000分别将WT、MUT与miR-486 mimics、mimics control共转染至细胞中，继续培养24 h以后，利用萤光素酶活性测定试剂盒检测萤光素酶活性变化。

2.6上调PTEN后，观察miR-486 mimics对LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响 用Lipofectamine 2000分别将miR-486 mimics和pcDNA 3.1-PTEN、miR-486 mimics和pcDNA 3.1共转染至肺泡上皮细胞中，使用含150 mg/L LPS的细胞培养液培养记为miR-486+pcDNA3.1+LPS组和miR-486+PTEN+LPS组。流式细胞术测定细胞凋亡变化，Western blot检测细胞中PTEN、C-caspase-3和C-caspase-9蛋白表达变化，步骤均同上。

3 统计学分析

实验数据用SPSS 21.0软件分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，两组数据间比较采用t检验，多组差异比较用单因素方差，组间比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-486 mimics上调LPS诱导的肺泡上皮细胞中miR-486的表达水平

肺泡上皮细胞经过LPS处理以后，细胞中的miR-486水平显著降低(P<0.05)，说明LPS诱导肺泡上皮细胞中miR-486表达下调；肺泡上皮细胞转染miR-486 mimics后，LPS刺激的细胞中miR-486的表达水平显著升高(P<0.05)，说明miR-486 mimics可以显著上调LPS诱导的肺泡上皮细胞中miR-486的表达水平，见表1。

表1 miR-486 mimics上调LPS诱导的肺泡上皮细胞中miR-486表达水平

Table 1. miR-486 mimics up-regulate the expression of miR-486 in LPS-induced alveolar epithelial cells (Mean±SD.n=3)

GroupmiR-486Control1.00±0.10LPS0.64±0.08∗miR-NC+LPS0.63±0.05miR-486+LPS1.35±0.12#

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsmiR-NC+LPS group.

2 miR-486 mimics减少LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡

肺泡上皮细胞经过LPS刺激以后，细胞凋亡率显著升高，细胞中C-caspase-3和C-caspase-9蛋白水平也显著升高(P<0.05)；转染miR-486 mimics后，LPS诱导的细胞凋亡率显著下调，并且细胞中的C-caspase-3和C-caspase-9蛋白水平显著降低(P<0.05)，见图1。结果提示miR-486 mimics减少LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡。

Figure 1. Effects of miR-486 mimics transfection on apoptosis of alveolar epithelial cells after LPS treatment.A: flow cytometry was used to detect apoptotic rate in each group; B: Western blot was used to detect the expression of C-caspase-3 and C-caspase-9 in cells of each group.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol grpup;#P<0.05vsmiR-NC+LPS group.

图1 miR-486 mimics转染对LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响

3 miR-486靶向调控PTEN的表达

靶基因预测软件发现miR-486同PTEN的3’-UTR端有互补结合位点，见图2；经过双萤光素酶报告系统鉴定发现PTEN为miR-486的靶基因，见表2。

Position 719-726 of PTEN 3’ UTR 5’...UGAAUCUGUAUUGGGGUACAGGA
hsa-miR-486 3’ GAGCCCCGUCGAGUCAUGUCCU

Figure 2. Target gene prediction software predicts that there are binding sites at the 3’UTR ends of PTEN and miR-486.

图2 靶基因预测软件预测miR-486与PTEN的3’UTR端有结合位点

表2 萤光素酶报告系统测定萤光素酶活性变化

Table 2. Luciferase activity changes determined by luciferase reporting system(Mean±SD.n=3)

GroupMUTWTmiR-NC1.00±0.071.00±0.11miR-4861.02±0.100.52±0.04∗

*P<0.01vsmiR-NC group.

4 miR-486 mimics下调LPS诱导的肺泡上皮细胞中PTEN的表达

LPS处理后的肺泡上皮细胞中的PTEN蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，转染miR-486 mimics后的肺泡上皮细胞中PTEN蛋白表达水平显著下降(P<0.05)，见图3，说明miR-486负调控PTEN蛋白的表达。

Figure 3. Effects of miR-486 mimics transfection on PTEN expression in LPS-treated alveolar epithelial cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmiR-NC+LPS group.

图3 miR-486 mimics转染对LPS处理的肺泡上皮细胞中PTEN蛋白表达的影响

5 上调PTEN逆转miR-486 mimics对LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡影响

将miR-486 mimics和pcDNA 3.1-PTEN共转染可以显著提高LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡水平，并促进细胞中PTEN、C-caspase-3和C-caspase-9蛋白的表达，与共转染miR-486 mimics和pcDNA 3.1的细胞比较，差异显著(P<0.05),见图4,说明上调PTEN可逆转miR-486 mimics对LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响。

讨 论

肺泡Ⅱ型上皮细胞具有分泌活性物质、维持肺泡气体交换等作用，在肺组织功能维持中具有关键作用[6]。LPS是内毒素的主要成分，也是肺组织中肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤发生的直接诱导因子[7]。我们的实验以LPS刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞，观察到LPS刺激可以提高细胞凋亡水平，说明成功构建了LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤模型。

miR-486是近年发现在人体组织中具有一系列生物学作用的miRNA分子，与造血细胞分化和干细胞衰老等正常生理学过程有关，还与心肌纤维化和肿瘤等有关[8-11]。miR-486在氧化应激及PM2.5诱导的肺泡上皮细胞凋亡中表达下调，并且上调miR-486可以减少细胞凋亡发生，从而发挥细胞保护的作用[5]。本实验观察到，LPS处理后的肺泡上皮细胞中的miR-486的表达水平下降，通过细胞转染的方法上调miR-486后可以显著减少LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡，这提示miR-486在肺组织损伤中可能发挥抗损伤作用。

现阶段对于miRNA的研究表明，其可以通过靶向调控靶基因的表达发挥各种生物学作用，并且同一个miR-486可能同时含有多个靶基因[12]。研究者们发现miR-486有GAB2、CLDN10、CITRON和Sirt1等多个靶基因，参与不同组织细胞的病理及生理过程[13-15]。本实验检测miR-486与PTEN有靶向结合互补位点，经过双萤光素酶系统鉴定PTEN为miR-486的靶基因。PTEN是一个与细胞凋亡有关的凋亡促进因子，其可以激活细胞中caspase级联反应诱导凋亡，在心肌缺血损伤、缺氧神经元损伤和脊柱损伤等过程中发挥保护作用[16-18]。caspase-3和caspase-9是caspase蛋白家族成员，只有被活化后形成C-caspase-3和C-caspase-9才可以诱导细胞凋亡的发生[19-21]。本研究显示，过表达miR-486可以降低肺泡上皮细胞中PTEN的表达，并且PTEN上调可以逆转miR-486 mimics对LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡及C-caspase-3、C-caspase-9表达的抑制作用，这提示miR-486可能通过靶向负调控PTEN的表达影响caspase级联反应从而减少LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡发生。

Figure 4. Effects of co-transfection of miR-486 mimics and pcDNA 3.1-PTEN on LPS-induced apoptosis of alveolar epithelial cells.A:the apoptotic rate of alveolar epithelial cells were detected by flow cytometry;B:Western blot was used to detect the expression of PTEN, C-caspase-3 and C-caspase-9 in alveolar epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-486+pcDNA 3.1+LPS group.

图4 miR-486 mimics和pcDNA 3.1-PTEN共转染对LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响

本次实验没有探讨PTEN通过何种靶向关系调控细胞凋亡，对于miR-486在原代肺泡Ⅱ型上皮细胞中的作用还不明确，在以后的实验中会进行具体的探讨。本次实验证实了miR-486在LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡中的作用，并且对于其机制进行了初步探讨，这对于研究miR-486在肺组织损伤中的调控网络具有参考价值。