流式细胞术免疫分型对多发性骨髓瘤的诊断价值

王星 张瑜 马列婷

多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一种恶性浆细胞疾病，属于B细胞淋巴瘤的一种，是骨髓浆细胞异常增殖性疾病。常常伴随有高钙血症、贫血、多发性溶骨性、肾脏等损害。患者患病后正常的免疫球蛋白的生成障碍，较为容易发生感染。发病早期无特异性临床症状，容易造成漏诊和误诊。多发生于中老年患者，若得不到及时治疗，严重威胁患者生命安全。临床诊断MM的方法较多，有影像学检查、临床症状及实验室检查等[1]。伴随着流式细胞术的不断发展，以客观、灵敏及快速的优势，在MM诊断中有较高应用价值，在病情检测、疗效评价及预后判断中有重要作用。本文通过收集我院56例MM患者，分析流式细胞术免疫分型对MM的诊断价值对比。

1 对象与方法

1.1 对象

抽取我院2016年1月—2018年12月收治的56例MM患者。纳入标准：均符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南》中的标准[2]；签署知情同意书，自愿参与此次研究，经我院医学理论会同意。排除标准：严重心肝肾功能障碍基础性疾病；其他血液系统疾病；精神病。

男34例，女22例；年龄43～71岁，平均（58.78±5.34）岁；组织器官损害：7例血钙增高，31例肾功损害，43例贫血，46例骨病变。DS分期：ⅠA 5例，ⅠB 7例，ⅡA 10例，ⅡB 17例，ⅢA 10例，ⅢB 7例。

1.2 研究方法

所有患者均给予骨髓细胞形态学检查、流式细胞术检查、毛细管免疫分型电泳、毛细管血清蛋白电泳。

（1）骨髓细胞形态学检查：抽取0.2 mL脊髓液，涂片、晾干、染色、去染、晾干，于涂片、染色良好体尾交界处按照一定顺序分类计数200个有核细胞，从而计算骨髓瘤细胞百分比。阳性标准：骨髓浆细胞超过10%。

（2）流式细胞术：采用Epics Eliet流式细胞仪，抽取2 mL肝素抗凝骨髓液，选择5～10×106细胞/mL单细胞悬液，每100 μL单细胞悬液与20 μL好的抗体室温避光孵育20分钟，加入氯化铵溶血剂维持液体。按照1 500 rpm，离心10 min，去除上清，并采用0.5 mL PBS重悬后上机，PBS洗涤2遍、避光破膜15 min，加入胞浆抗体孵育30 min，洗涤1次后采用0.5 mL PBS重悬。采用BD FACSDiva软件获取、记录及分析数据。每管分析10 000个细胞，将荧光强度轴设定为对数模式，并以CD45/SSC联合CD38/CD138设门分析评估骨髓取材。用于多发性骨髓瘤细胞免疫分型的抗体有CD45，CD38，CD138，CD19，CD56，胞内Kappa轻链，胞内labda轻链。收集CD38＋＋／CD45-／＋细胞10 000个，利用同型对照设置Cut Off值，细胞群在某一抗原轴方向整体位移超出Cut Off线≥20%判定为该抗原表达阳性。

（3）毛细管免疫分型电泳：促凝全血标本3 000 r/min离心15分钟分离血清，样本同配套试剂一同放入全自动毛细管电泳仪上反应、电泳、扫描及判定结果。每个样本进行6次血清蛋白电泳，其中一次为标准血清蛋白电泳，另外五次为加入抗IgM、IgA、IgG、k、γ抗体反应后的电泳。阳性标准：在标准血清蛋白电泳图形中出现底部狭窄、高尖的异常蛋白峰，在加入抗IgM、IgA、IgG、k、γ抗体后的电泳图形中，如出现异常蛋白峰的消失则为相应类型的克隆性Ig。

（4）毛细管血清蛋白电泳：用Sebia Capillarys全自动毛细管电泳仪及配套试剂，促凝全血标本3 000 r/min离心15分钟分离血清，在全自动毛细管电泳仪上电泳分离、扫描及判定结果。阳性标准：扫描图中α、β、γ区域底部狭窄，高尖的异常蛋白峰为阳性。

1.3 观察指标

（1）记录MM患者骨髓细胞形态学检查、流式细胞术通过CD45/SSC联合CD38/CD138设门分析检测、毛细管免疫分型电泳、毛细管血清蛋白电泳检测的阳性率；（2）记录流式细胞术与骨髓细胞形态学检测出的骨髓异常浆细胞的比例；（3）记录流式细胞术对MM的分型结果及毛细管免疫分型电泳对MM的分型结果。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 比较各种检查结果阳性率

（1）骨髓细胞形态学检查：骨髓细胞形态学检测阳性率为100%(56/56)，高于流式细胞术检测阳性率96.43%（54/56），但差异无统计学意义（P＞0.05）（注：骨髓细胞形态学与流式细胞术对比：χ2=0.073，P=0.674）；高于毛细管免疫分型电泳检测阳性率85.71%（48/56）及毛细管血清蛋白电泳检测阳性率83.93%（47/56），差异具有统计学意义（P＜0.05）（注：骨髓细胞形态学与毛细管免疫分型电泳对比：χ2=5.653，P=0.015；骨髓细胞形态学与毛细管血清蛋白电泳对比：χ2=6.471，P=0.009）;（2）流式细胞术检测：流式细胞术检测阳性率为96.43%（54/56），阳性检出率高于毛细管免疫分型电泳检测阳性率85.71%（48/56）及毛细管血清蛋白电泳检测阳性率83.93%（47/56），差异具有统计学意义（P＜0.05）（注：流式细胞术与毛细管免疫分型电泳对比：χ2=3.953，P=0.047；流式细胞术与毛细管血清蛋白电泳对比：χ2=4.940，P=0.026）；（3）毛细管免疫分型电泳与毛细管血清蛋白电泳检查阳性率分别为85.71%（48/56）、83.93%（47/56），差异无统计学意义（P＞0.05）（注：毛细管免疫分型电泳与毛细管血清蛋白电泳对比：χ2=0.069，P=0.792）。

表1 流式细胞术及毛细管免疫分型电泳对MM 的免疫球蛋白kappa 型轻链分型结果比较

表2 流式细胞术及毛细管免疫分型电泳对MM 的免疫球蛋白Labda 型轻链分型结果比较

2.2 比较流式细胞术与骨髓细胞形态学检出的异常浆细胞的比例

通过CD45/SSC联合CD38/CD138设门分析，将CD45/SSC联合CD38+/CD138+作为鉴别异常浆细胞的特异性指标，发现56例MM患者中54例在CD45/SSC散点图可见异常细胞群，结合CD38/CD138鉴别为异常浆细胞，见图1。通过流式细胞仪检测到此54例阳性患者中的异常浆细胞比例为（33.59±8.41）%，低于同时期的骨髓细胞形态学检查的骨髓浆细胞比例（43.25±10.82）%，二者做线性相关统计分析，结果pearson相关系数r=0.82，tr=10.528，P＜0.05，表明二者呈线性正相关。

2.3 比较流式细胞术及毛细管免疫分型电泳对MM的分型结果

流式细胞学检查56例MM患者中有54例MM的免疫球蛋白呈阳性表达，其中胞内Kappa轻链单克隆21例（38.9%），胞内labda轻链单克隆33例（61.1%）。毛细管免疫分型电泳检查56例MM患者中48例MM分泌免疫球蛋白，其中表达Kappa轻链型的18例（37.5%），表达Labda轻链型的30例（62.5%），有3例流式细胞术胞内Kappa轻链阳性而毛细管免疫分型电泳为阴性，差异无统计学意义（P＞0.05）（注：流式细胞术及毛细管免疫分型电泳对 MM的免疫球蛋白kappa型轻链分型结果比较：χ2=1.333，P=0.243），有3例流式细胞术胞内labda轻链阳性而毛细管免疫分型电泳为阴性，差异无统计学意义（P＞0.05）（注：流式细胞术及毛细管免疫分型电泳对MM的免疫球蛋白labda型轻链分型结果比较：χ2=1.333，P=0.243），具体见表1、表2。

3 讨论

MM可以归到B淋巴细胞淋巴瘤的范围，其临床表现较复杂，且缺乏特异性，早期诊断时极易误诊或漏诊，耽误最佳治疗时机[3-4]。骨髓涂片细胞形态学具有直观、经济及操作简单的特点，是最先用于MM患者诊断中[5]。MM细胞髓内浸润、增值范围不同，经过形态学检查往往需要多次骨髓穿刺，有着较大差异性[6-7]。同时，在阅片选择及细胞识别上，较强主观性，与反应性浆细胞增多相鉴别，从而增加误诊。毛细管血清蛋白电泳、毛细管免疫分型电泳可有效检测骨髓瘤细胞产生并释放入血的M蛋白，有较小创伤性，且具有快捷性及经济性[8-9]。流式细胞术免疫分型可快速准确客观鉴别出浆液细胞的良恶性，可客观及评估恶性浆液细胞，并且能够揭示骨髓瘤细胞免疫表型的异质性及其胞内轻链的克隆性。以上特点是毛细管血清蛋白电泳和毛细管免疫分型电泳技术无法达到的[10]。

图1 流式细胞术CD45/SSC 联合CD38/CD138 设门分析

流式细胞术在多发性骨髓瘤中的应用涉及以下几方面：通过检测浆细胞免疫表型、克隆性，可明确浆细胞是否是良性、恶性，还是反应性的。流式细胞术可识别瘤细胞独有的异常免疫常型，从复杂的骨髓细胞群中可圈出极其微量的瘤细胞；CD38、CD138为浆细胞特异性的表面标志物，CD45在正常浆细胞弱表达而在骨髓瘤细胞表达减低或不表达，CD19在正常浆细胞表达而在骨髓瘤细胞弱表达或不表达，CD56在正常浆细胞不表达而在骨髓瘤细胞中表达增高，且被认为是疾病预后不良的标志之一，cKappa轻链与clabda轻链在正常浆细胞呈多克隆表达，而在骨髓瘤细胞中为限制性表达[11]。同时可实现瘤细胞膜及胞内分子检测，发现胞内轻链限制性表达，并不受到分泌与否及分泌多寡的影响。在本次研究中，通过流式细胞术对胞浆轻链限制性表达的一般特点给予抗体设置，其检出率高于其他检测方法。同时，本研究中有2例患者的流式细胞术结果为阴性，可能与多发性骨髓瘤的取材相关[3，12]。流式细胞术的应用较为成熟，应用于免疫分型具有较高的准确性。

综上所述，流式细胞术免疫分型对MM的诊断有较高价值，可作为诊断MM的有效手段。