原花青素对反式脂肪酸致小鼠肝脏损伤的修复作用

王友良 甘功友 张冬初 刘艳华 何卫国 陈静

摘 要：目的：探讨原花青素（Proanthocyanidins， PC）对反式脂肪酸（trans fatty acids， TFAs）染毒小鼠肝脏损伤的修复及其可能机制。方法：将50只成年昆明（KM）小鼠（雌雄各半）随机分为5组，正常对照组、TFA组（100 mg·kg-1剂量的TFA）、TFA+低、中、高剂量PC组（100 mg·kg-1剂量的TFA+50、100、150 mg·kg-1剂量的PC），隔天灌胃生理盐水和反式脂肪酸，总共灌胃60天，待实验结束后，检测小鼠丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量，并对肝脏组织进行病理检测。结果：与对照组比较，TFA染毒组小鼠体重、肝脏脏器系数、ALT、AST及MDA含量增加（P<0.05）;SOD、GSH-Px活性降低（P<0.05）;肝脏组织结构中肝小叶出现紊乱，肝细胞出现不同程度的坏死;与TFA染毒组相比，TFA+低、中、高PC组小鼠体重、肝脏脏器系数、ALT、AST及MDA含量降低（P<0.05）;SOD、GSH-Px活性提高（P<0.05）;且肝脏的损伤程度得到了明显改善。结论：PC对TFA染毒小鼠的肝脏损伤具有保护作用，实验表明其机制可能与原花青素具有抑制细胞损伤和清除氧自由基的作用有关。

关键词：原花青素;反式脂肪酸;肝脏损伤;抗氧化

Abstract：Objective： To investigate the effect of proantho cyanidins （PC） on liver injury induced by trans fatty acids （TFA） in mice and its possible mechanism. Methods Fifty adult KM mice （half male and half female） were randomly divided into 5 groups： Normal control group， TFA group （100 mg·kg-1 TFA）， TFA + low， medium and high doses PC group （100 mg·kg-1 TFA + 50， 100， 150 mg·kg-1 PC） were perfused with normal saline and trans fatty acids every other day for

60 days. After the experiment， the levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST） and superoxide dismutase （SOD） were detected. Results Compared with the control group， the body weight， liver viscera coefficient， ALT， AST and MDA contents in TFA-exposed mice increased （P<0.05）. The activities of SOD and GSH-Px were decreased （P<0.05）. The hepatic lobules appeared disorder in the liver tissue structure， and the hepatocytes appeared necrosis in varying degrees. Compared with TFA exposure group， the body weight， liver organ coefficient， ALT， AST and MDA contents in TFA + low， medium and high PC groups were decreased （P<0.05）. The activities of SOD and GSH-Px increased （P<0.05）. And the degree of liver injury was significantly improved. Conclusion： PC has protective effect on liver injury induced by TFA in mice. The mechanism may be related to the inhibition of cell injury and scavenging of oxygen free radicals by procyanidins.

Key words：Proanthocyanidins; Trans fatty acid; Liver injury; Anti-oxidative

中圖分类号：R285.5

原花青素（proantho cyanidins，PC）是广泛存在于山楂、葡萄籽、玉米、蓝莓、桑葚和松树皮等植物中的一大类多酚化合物的总称，目前国际上公认其为清除机体自由基最有效的天然抗氧化剂[1]。诸多研究表明，原花青素具有多种生物活性，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、纠正胰岛素抵抗、保护心血管功能等作用[2-4]，

目前研究发现，原花青素可拮抗反式脂肪酸所致的小鼠肝脏毒性，但关于PC修复反式脂肪酸肝脏毒性的研究未见报道，本实验以小鼠为研究对象，对小鼠给予原花青素干预，然后进行TAF染毒，探讨PC的预防修复作用。

反式脂肪酸（Trans fatty acids，TFA）是一类含有反式构型非共轭双键的不饱和脂肪酸的总称[5]。研究表明，在一些油炸食品、人造奶油、面包、蛋糕、饼干、炸薯条、炸薯片奶油和黄油等食品中含有大量的TFA[6-7]。

然而，在光、热及催化剂的作用下，在食物油脂的氢化过程中，顺式脂肪酸可以转变为TFA[8]。TFA能够增加食品的松脆口感、且具有易于长期保存的特点，从而被广泛应用于各类包装食品和煎炸食品中。研究证实，长期食用含有TFA的食物会导致肝组织损伤及肝细胞变性和坏死[9]。最新研究表明，TFA可导致肝脏脂肪堆积、肝细胞变性、引发非酒精性脂肪肝[10]。

本实验观察了反式脂肪酸对小鼠肝脏损伤的影响，并探讨了原花青素对TFA导致的肝脏损伤保护作用机制，为预防生活中食品中TFA所致肝脏损伤提供有效的实验线索和依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

试验对象为购自南华大学实验动物室的昆明（KM）种健康成年小鼠（雌雄各半）50只，体重为25～30 g，实验动物使用许可证号：（SCXK[湘]2016-0009）。试验期间，动物在实验房中饲养，房间温度为26 ℃左右，相对湿度为55%～70%，24 h光照明暗交替，实验动物自由饮水和进食，适应性饲养7 d，将实验小鼠随机分为5组：正常对照组、TFA组（100 mg·kg-1剂量的TFA）、TFA+低、中、高剂量PC组（100 mg·kg-1剂量的TFA+50、100、150 mg·kg-1剂量的PC）。

1.2 仪器与试剂

原花青素（纯度>95%，江苏江莱生物科技有限公司）;反式脂肪酸（纯度>95%，上海惠城生物科技有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）试剂盒均购自上海如吉生物科技发展有限公司;CK-40光学显微镜（日本OLYMPUS公司）;7170 A自动生化分析仪（日本OLYMPUS公司）;FB124精密电子分析天平（上海力辰仪器科技有限公司）;TDL-60B低速台式离心机（上海重逢科学仪器有限公司）;5810型低温高速离心机（德国Eppendorf）。

1.3 实验方法

给予灌胃方式进行染毒，上午灌胃TFA，下午给予PC，连续灌胃90 d，期间密切观察小鼠的生长发育情况。试验结束后，各组小鼠称重，并处死小鼠，取小鼠血液，摘除小鼠肝脏，用电子分析天平准确称取肝脏重量，计算其脏器系数。小鼠肝脏用0～4 ℃的生理盐水漂洗，用滤纸拭干，称重后用小烧杯将其装好。将肝脏组织匀浆并离心，取上清液保存以备检测。用生化分析仪检测小鼠肝脏组织匀浆的蛋白含量、谷丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、MDA、SOD及GSH-Px等的含量，相关具体操作步骤都要严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计数据分析

结果数据用均数±标准差（x±s）表示，以

P<0.05为差异有显著性，均进行合并分析。应用SPSS 19.0统计软件进行分析处理，多组间比较采用多样本均数方差分析，各处理组与对照组间的比较采用卡方检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PC对TFA染毒小鼠体重及肝脏脏器系数的影响

结果如表1所示，各组小鼠初体重相差不大，差别均无统计学意义（P<0.05）;TFA染毒组及低剂量PC保护组小鼠的终体重增长高于对照组（P<0.05）;

给予不同剂量PC后的TFA染毒组的小鼠体重增长量均低于TFA染毒组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

TFA染毒组及低、中剂量PC保护组小鼠的肝脏脏器系数均显著高于对照组（P<0.05）;经低、中、高剂量PC保护的各组小鼠的肝脏脏器系数低于TFA染毒组（P<0.05）。

2.2 PC对TFA染毒小鼠小鼠肝脏组织的形态学改变

由圖可见，对照组小鼠肝组织病理形态结构正常，肝中央静脉、肝索结构清晰可见，未见肝细胞变性、坏死等病理改变（见图1a）。TFA染毒组镜下可见肝细胞弥漫性大片溶解坏死，肝索离散，静脉扩张，肝小叶结构紊乱，肝细胞脂肪变性，肝细胞核的改变为可见核固缩、核碎裂、核溶解，并可见坏死碎片（见图1b）。TFA染毒+低剂量PC保护组可见肝细胞变性、胞浆疏松化和气球样变性（见图1c）。TFA染毒+中剂量PC保护组可见肝窦扩张，且可见肝小叶轮廓，少量肝细胞体积增大，伴少量肝细胞坏死和炎症细胞浸润（见图1d）。TFA染毒+高剂量PC保护组肝细胞的形态结构大致正常，肝细胞水肿和脂肪变性都有所减轻，坏死组织减少（见图1e）。

2.3 PC对TFA染毒小鼠血清肝脏功能指标变化的影响

与模型对照组相比，TFA染毒组及低、中、高剂量PC保护组小鼠的血清ALT、AST含量均有所增加

（P<0.05）;表明长期给予TFA可在一定程度上导致小鼠肝功能损伤。与TFA染毒组相比，各剂量PC保护组小鼠血清中ALT、AST的活性均有不同程度的降低，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.4 肝脏组织氧化损伤变化

SOD和MDA含量的组间差异有统计学意义

（P<0.05）。与对照组相比，TFA染毒组及低、中剂量PC保护组小鼠肝脏组织匀浆中GSH-Px和SOD含量下降，MDA含量升高（P<0.05），各剂量PC保护组的小鼠肝脏组织匀浆中GSH-Px和SOD含量升高，MDA含量降低（P<0.05），见表3。

3 讨论

肝脏是机体重要的解毒器官，当有害物质超过肝脏所能承受的量时，肝脏便不能有效清除这些有毒物质，致使肝功能受损进而导致机体发生相关疾病[11]。

脏器系数的变化可反映受试物对肝脏器的毒性情况，也是寻找毒物靶器官的重要线索[12]。本次实验结果表明，TFA组体重明显增长，说明TFA染毒可导致肥胖;而脏器系数高于对照组（P<0.05），说明TFA染毒可对肝脏产生影响，而给予PC保护后，肝脏脏器系数有改变，说明PC有一定的干预作用。肝组织病理改变可见肝细胞弥漫性大片溶解坏死，肝索离散，静脉扩张，肝小叶结构紊乱，肝细胞脂肪变性，肝细胞核改变，并可见碎片坏死，证明小鼠反式脂肪酸肝损伤模型造模成功。而经低、中、高PC保护的3组中随PC剂量的增加，体重增长减慢，肝脏脏器系数变小，小鼠肝脏病理组织结构形态有一定改善，说明PC可修复TFA引起的肝脏损伤。ALT、AST是机体肝脏中广泛存在的重要氨基酸转氨酶，也是指示肝功能的重要指标[13-14]。ALT、AST这两种酶在正常情况下存在肝细胞中，当肝细胞发生病变时，通过质膜漏出胞外，因而这两种酶在血液中的活性变化可准确、敏感地反映肝脏的功能[15]。ALT与AST升高表明肝脏细胞已氧化受损[16]。本实验结果表明，反式脂肪酸明显损伤了肝脏的功能，从而导致小鼠肝脏中ALT与AST活性升高，但给予各剂量的PC保护后，二者水平明显降低，说明PC对TFA所致的肝损伤具有一定的保护作用。实验结果发现，当PC与TFA两种因素同时作用于雄性小鼠时，对小鼠肝脏组织中的AST、ALT含量有拮抗作用，即PC能够拮抗TFA所致的肝损伤，可能与PC具有良好的抗氧化功能有关。

4 结论

本研究结果显示：与对照组相比，TFA染毒组小鼠肝脏的GSH-Px、SOD活性有明显下降，MDA含量升高，说明TFA对小鼠体内氧化与抗氧化系统的平衡起破坏作用，减弱机体的抗氧化损伤能力，从而增强脂质的过氧化作用，对肝细胞造成不同程度的损害。而不同剂量的PC保护组的肝脏SOD、GSH-Px活性均有增高，MDA含量均下降，表明PC具有很强的抗氧化活性和清除自由基的功能，是一种良好的脂质过氧化抑制剂和氧自由基清除剂[17，18]，可以减弱反式脂肪酸对机体的损伤。综上所述，原花青素具有修复肝脏细胞和保护肝功能的作用，其相关机制可能与原花青素具有抗脂质过氧化和清除氧自由基的作用有关。本实验采用原花青素修复反式脂肪酸所致的肝损伤，为后续研究原花青素对过氧化所致的肝损伤的修复机制提供新的思路。

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