水提法同步提取分离香菇中蛋白质和多糖的工艺研究

胡丽玲 刘世柱 吴志君 周晓云 陈雯雯

水提法同步提取分离香菇中蛋白质和多糖的工艺研究

胡丽玲 刘世柱 吴志君 周晓云 陈雯雯

（浙江方格药业有限公司，浙江 庆元 323800）

通过水提法同步提取分离香菇中的蛋白质和多糖，采用单因素实验研究料液比、提取温度、提取时间与蛋白质和多糖提取率的关系，并通过正交实验优化工艺条件。结果为，影响蛋白质提取率的主次因素为提取温度＞料液比＞提取时间；影响多糖提取率的主次因素为料液比＞提取温度＞提取时间。综合分析得到提取的最佳工艺组合为料液比20、提取温度100 ℃、提取时间3.5 h（二次提取）。该组合下蛋白质提取率为6.90%，多糖提取率达38.50%。

香菇；蛋白质；多糖；提取率；影响因素

香菇，又名花菇、冬菇等，属担子菌纲伞菌目口蘑科香菇属，是世界上第二大食用菌品种[1]。其味道鲜美，含有丰富的多糖和蛋白质，药用价值高，是一种集营养、保健和药用价值于一体的药食两用真菌[2]。现代医学研究表明，香菇多糖具有抗病毒[3]、抗肿瘤[4]、抗疲劳[5]等多方面的生物活性，可提高机体免疫力，对维护人类健康和预防疾病有重大意义[6, 7]。

目前国内对香菇多糖的研究较多，对香菇蛋白质提取研究较少。本研究通过水提法，以提取时间、料液比、提取温度为考察因素，提取分离香菇中蛋白质和多糖，采用正交试验法优化提取条件，以利于充分利用香菇原料资源，促进深加工，提高产品附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇干品来源于浙江庆元，粉碎过80目筛。试剂包括盐酸、氢氧化钠、苯酚、硫酸、无水乙醇、蒸馏水、D-无水葡萄糖保准品、牛血清蛋白标准品和考马斯亮蓝G-250等。仪器与设备：粉碎机、离心机、旋转蒸发仪、紫外分光光度计和烘箱等。

1.2 实验方法

（1）水提法提取流程。称取一定量的香菇粉末，加入一定量蒸馏水，在一定温度下水提，3 000 r/min，离心10 min，取上清液，沉渣加入一定量的纯化水进行二次提取，3 000 r/min离心10 min，弃去沉渣，合并滤液。

（2）蛋白质等电点确定。将上清液分为若干等份，配制1 mol/L盐酸溶液，25 ℃下调pH至酸性，蛋白质沉淀完全后，3 000 r/min离心10 min，上清液采用考马斯亮蓝法检测蛋白质残留率，残留率最低的为蛋白质等电点。

（3）蛋白质检测。沉淀加入一定量的水溶解，于65 ℃下烘干称重，检测蛋白质提取率。采用考马斯亮蓝法[8]，精确称取100 mg的牛血清蛋白标准品，用蒸馏水定容至100 mL，得到1 mg/ mL的牛血清蛋白标准品溶液。用移液枪分别吸取0，0.01 mL，0.02 mL，0.04 mL，0.06 mL，0.08 mL，0.10 mL于10 mL具塞试管中，加水补至0.10 mL，摇匀后再分别加入考马斯亮蓝G-250试剂5 mL，摇匀，放置2分钟于595 nm下检测吸光度值，绘制标准曲线。

（4）多糖检测。合并蛋白质沉淀后的上清液，25 ℃下用1 mol/L NaOH调节pH至中性，65～70 ℃下旋蒸浓缩，加入4倍量乙醇进行沉淀，3 000 r/min离心10 min，沉淀加入一定量水溶解，65 ℃下烘干称重，检测多糖提取率。采用苯酚-硫酸法[9]，精确称取10 mg D-无水葡萄糖标准品，用蒸馏水定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的葡萄糖标准品溶液。分别吸取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于25 mL具塞试管中，加水补至1.0 mL，摇匀，加1 mL 5%苯酚溶液，摇匀，加5 mL 硫酸，摇匀，静置10 min。待充分混合，30 ℃下水浴20 min，冷却至室温，于490 nm下检测吸光度值，绘制标准曲线。

（5）单因素实验。在单因素实验中，分别考察料液比、提取温度、提取时间对蛋白质和多糖提取率的影响。

（6）正交实验。在单因素实验的基础上，选取3个单因素实验中的最佳实验条件，采用L9（33）正交设计对蛋白质和多糖提取条件进行优化。

2 结果与分析

2.1 蛋白质等电点确定

用1 mol/L HCl调节pH至3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1，静置过夜沉淀后，离心，上清液采用考马斯亮蓝法检测蛋白质含量，结果见图1。当pH=3.7时，上清液中蛋白质残留量最低，说明沉淀的蛋白质含量最多；pH在3.4～3.6之间，上清液蛋白质残留量相差不大；pH在3.8～4.2之间，上清液蛋白质残留量呈上升趋势。因此选择pH 3.7为蛋白质的等电点。

图1 不同pH条件下的上清液蛋白质含量

2.2 单因素实验结果

（1）料液比与蛋白质和多糖提取率的关系。实验结果（表1）表明，在提取温度80 ℃，提取时间3.5 h的条件下，随料液比增大，蛋白质和多糖提取率呈先上升后下降趋势。料液比为20时，提取率最大，蛋白质和多糖提取率分别为5.63%和34.86%；料液比达到30时，提取率最低，分别为5.46%和33.91%。因此，正交试验选取料液比范围以20～25为宜。

表1 不同料液比下的蛋白质和多糖提取率

（2）温度与蛋白质和多糖提取率的关系。实验结果（表2）表明，在料液比为20，提取时间为3.5 h的条件下，随着提取温度的升高，蛋白质和多糖提取率呈现不断上升趋势，90 ℃时蛋白质和多糖的提取率分别6.53%和35.76%；100 ℃条件下多糖提取率略有下降，但差别不明显。综合考虑，正交试验选取提取温度的范围以80～100 ℃为宜。

（3）提取时间与蛋白质和多糖提取率的关系。

表2 不同温度下蛋白质和多糖的提取率

实验结果（表3）表明，在料液比为20，提取温度为90 ℃条件下，随着提取时间的增加，蛋白质和多糖提取率均呈上升趋势，提取时间4.5 h时，蛋白质和多糖提取率均达到最大值，分别为6.58%和36.45%。综合考虑，正交试验选取提取时间范围以3.5～4.5 h为宜。

表3 不同提取时间的蛋白质和多糖的提取率

2.3 正交试验结果与分析

通过分析可知，对于蛋白质提取，提取温度（B）对蛋白质提取率的效果最强，为主要因素，提取时间（C）对提取效果最弱。实验表明，影响蛋白质提取率的主次因素为B＞A＞C，提取的最优水平组合为B3A3C3（表4、表5）。

表4 正交试验结果

对于多糖提取，料液比（A）的极差最大，对提取的效果最强，为主要因素，提取时间（C）对多糖提取的效果最弱。实验表明，影响多糖提取率的主次因素为A＞B＞C，多糖提取的最优水平组合为A2B3C1。

综合分析，两者的最佳工艺组合为A2B3C1，即料液比为20、提取温度为100 ℃、提取时间为3.5 h，该组合下蛋白质提取率达6.90%，多糖提取率达38.50%。

表5 蛋白质和多糖提取率极差分析

3 结 论

本实验通过水提法同步提取分离香菇中蛋白质和多糖，采用单因素实验研究料液比、提取温度、提取时间对蛋白质和多糖提取率的影响，并通过正交实验优化工艺条件。结果为影响蛋白质提取率的主次因素为提取温度＞料液比＞提取时间；影响多糖提取率的主次因素为料液比＞提取温度＞提取时间。综合分析得两者的最佳工艺组合为料液比20、提取温度100 ℃、提取时间3.5 h，在此条件下蛋白质提取率达6.90%，多糖提取率达38.50%。该工艺操作简便，成本低廉，蛋白质和多糖提取效果显著，能为香菇蛋白质和多糖工业化生产提供科学依据。

[1] 李月梅. 香菇的研究现状及发展前景[J]. 微生物学报, 2005, 32(4): 149-152.

[2] 林楠, 钟耀广, 王淑琴, 等. 超高压提取香菇多糖的研究[J]. 现代食品科技, 2010,26(9): 991-993.

[3] 张福明, 张淑琴. 香菇多糖对流感病毒的抑制作用[J].长春中医药大学学报, 2006, 22(4): 11-12.

[4] 袁静, 王平全. 香菇多糖抗肿瘤作用的研究进展[J]. 中国药房, 1999, 10(5): 233-234.

[5] 杨娟, 吴谋成, 张声华, 等. 香菇蛋白多糖抗疲劳作用研究[J]. 营养学报, 2001, 23(4): 350-353.

[6] 边洪荣, 李小娜, 潘海宇. 香菇有效成分提取分离及分析方法研究进展[J]. 中草药, 2002(9):附1-2.

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胡丽玲（1992—），女，学士，主要从事医药食品科研工作。

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2095-0934（2019）05-316-04