伴不同gH基因型人巨细胞病毒感染的免疫性血小板减少症患儿临床特征研究

张小同 陈露燕

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是一种获得性免疫介导的疾病，其特征为由于血小板破坏过多或产血小板减少引起的外周血血小板减少，以广泛的皮肤黏膜出血为主要临床表现。ITP是儿童常见的出血性疾病，发病率约为（4～5）/10万，5岁以下儿童多见，约7/10万，儿童男性发病率较女性高。大部分患儿于发病后1～6个月内痊愈，10%～20%患儿呈慢性病程。病死率为0.5%～1.0%，主要致死原因为颅内出血。约2/3 ITP患儿有前驱感染史，其中人巨细胞病毒（hu－man cytomegalovirus，HCMV）感染率较高，阳性率约20%～50%[1-2]。

HCMV的基因为线性双股DNA分子，长约240 kb，由长单一序列（long unique sequence，UL）和短单一序列（short unique sequence，US） 组成。包膜糖蛋白 H（glycoprotein H,gH）是HCMV进入宿主细胞所需的两种糖蛋白复合物（gH/gL/gO和gH/gL/UL128/UL130/UL131A）的主要组成成分。已有研究显示，HCMV gH基因多态性与疾病分布、临床表现存在相关[3-4]。本研究针对伴HCMV感染的ITP患儿，研究gH基因多态性与其临床表现、预后的关系，为临床诊治及科学研究提供参考。

1 对象和方法

1.2 Taqman探针荧光定量PCR检测gH基因型

1.2.1 仪器和试剂 采用ABI7500荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）。在gH基因两端的保守区设计引物，正向引物序列：TGTTTTCACGCAGGAAGCGG，反向引物序列：TGGATCACGCCGCTGAACC。在gH基因的分型位置设计两种探针，一种探针识别gHl分型，另一种探针识别gH2分型。gHl型探针5′端用FAM标记，3′端用 BHQl标记，序列：FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1；gH2 型探针 5′端用 HEx 标记，3′端用 BHQl标记，序列：HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1。引物、探针均由宝生物公司（日本大津市）合成。

1.2.2 方法 采用RTFQ PCR法同时进行HCMV定量及gH分型。利用荧光杂交探针在一次PCR反应中同时检测和鉴别HCMV gH1和HCMV gH2基因型。该方法能够快速、稳定、明确区分两种HCMV gH基因型[9]。

1.3 治疗 ITP治疗方案参考2013年《儿童原发性免疫性血小板减少症诊疗建议》[12]：（1）PLT＜20×109/L，伴活动性出血或有治疗要求予抗ITP治疗；（2）PLT（20～100）×109/L，无活动性出血，1～3d 监测血常规；（3）PLT恢复至100×109/L后每1～2周监测血常规，至少随访3个月。抗病毒治疗指征和方案参考2012年中华医学会《儿童巨细胞病毒性疾病诊断和防治的建议》[8]。

1.4 预后评估[5]完全恢复：3个月内PLT恢复至100×109/L（相隔7d以上测定2次）。持续性 ITP：PLT＜100×109/L持续超过3个月。

1.5 统计学处理 采用SPSS 14.0统计软件。正态分布计量资料用表示，组间比较采用t检验；非正态分布计量资料用中位数及范围表示，组间比较用非参数检验。计数资料用百分比（%）表示，组间比较用χ2检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 一般资料 研究期间共新诊断136例ITP患儿，66例HCMV DNA阳性，阳性率48.5%，因19例失访，故41例新诊断ITP纳入本研究。其中gH1组26例（63.4%），gH2组型15例（36.6%）；男27例，女14例，男女比例1.9:1，两组男性比例无统计学差异（15/26比12/15，χ2=2.105，P=0.147）；月龄中位数 4.0（0，15）个月，gH1组月龄 3.5（0，15）个月，和 gH2 组[月龄 4.0（0,15）个月]比较差异无统计学意义（Z=-0.736，P=0.462），其中＜1岁婴儿37例，占90.2%。

2.2 不同发病时间ITP患儿的HCMV gH基因型分布情况 将41例新诊断ITP患儿按不同HCMV发病时间将患儿分为3组，＜3周为先天性感染组，＜3月龄为围生期感染组，≥3月龄为生后感染组。3组患儿的gH基因型分布情况见表1。

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表1 不同发病时间ITP患儿的HCMV gH基因型分布情况（例）

由表1可见，HCMV gH基因型在不同感染年龄组中分布均无统计学差异（均P＞0.05），均以gH1型多见。

先天性HCMV感染6例，占新诊断ITP患儿的14.6%，其中5例先天性HCMV感染患儿（4例gH1型和1例gH2型）伴神经系统影像学异常，表现为脑室扩张、室管膜下出血、室管膜下囊肿、脑白质信号异常、皮层发育不良等。

2.3 41例不同HCMV gH基因型 ITP患儿临床表现、治疗及预后比较 见表2。

表2 41例不同HCMV gH基因型ITP患儿临床表现、治疗及预后比较（例）

由表2可见，两组患儿临床表现差异均无统计学意义（均P＞0.05）。两组治疗措施差异均无统计学意义（均P＞0.05）。gH2组3个月内PLT完全恢复率较gH1组低（P=0.018）；两组PLT完全恢复时间比较，差异无统计学意义（P=0.804）。

2.4 41例不同HCMV gH基因型ITP患儿实验室指标比较 见表3。

由表3可见，本研究全部病例均行HCMV IgM测定，阳性率31.7%。4例行pp65测定，阳性比例2/4。34例行血小板抗体检查均阳性，其中8例血小板抗体≥80%。21例有骨髓涂片报告，包括gH1型13例，gH2型8例，其中13例有巨核细胞增生，13例产板功能异常。gH2型高血小板抗体比例稍高于gH1型，但差异无统计学意义（P=0.228），gH2型骨髓检查巨核细胞增生比例稍高于gH1型，但差异无统计学意义（P=0.400），两组各项实验室检查及骨髓检查均无明显统计学差异。

表3 41例不同HCMV gH基因型ITP患儿实验室指标比较（例）

3 讨论

ITP是一种儿童常见的血液系统疾病，以血小板减少、皮肤黏膜出血为主要表现。原发性ITP定义为单纯的免疫系相关的血小板减少，没有任何明显发病原因或潜在因素。继发性ITP指除原发性免疫性血小板减少症外所有其他免疫性血小板减少症。儿童ITP的临床出血症状与血小板减少的程度不一致，部分患者仅有血小板减少，没有出血症状，故2009年ITP国际工作组将“特发性血小板减少性紫癜”更名为“免疫性血小板减少症”。ITP按病程长短分三型：（1）新诊断ITP（newly diagnosed ITP）：病程＜3 个月；（2）持续性 ITP（persistent ITP）：病程 3～12 个月；（3）慢性 ITP（chronic ITP）：病程＞12 个月。本研究以新诊断ITP患儿为研究对象。ITP迄今发病机制尚不十分明确，可能与病毒感染、预防接种、免疫系统疾病、免疫缺陷、结核等相关。目前所知与ITP相关的病原体有十余种，如HCMV、EB病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、水痘病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、幽门螺杆菌等,其中HCMV感染率较高。

临床已开展的检测HCMV活动性感染指标以血清IgM、pp65阳性为主，但是HCMV感染约2周后IgM抗体才能达到能检测到的水平.此时病原体有可能已被机体免疫反应抑制而处于潜伏感染状态。婴幼儿免疫系统发育尚不完善，不能产生足够的特异性IgM抗体，灵敏度低,易造成假阴性结果[7]。祝兴元等[10]研究显示，血pp65检测的特异度达100%，但灵敏度只有59.2%。郑晓群等[7]研究指出，HCMV感染婴儿与新生儿、幼儿相比，尿液上皮细胞DNA检测灵敏度更高。当婴儿尿液上皮细胞DNA拷贝对数值为4.55（即拷贝数3.5×104）时,尿液上皮细胞中HCMV DNA载量对活动性感染诊断的灵敏度和特异度分别为71.4%和75.2%。因此，本研究中婴儿HCMV活动性感染诊断取尿上皮细胞DNA载量对数≥4.55或血IgM、pp65至少一项阳性。

HCMV包膜糖蛋白基因存在多态性，目前国内外研究较多的如gB、gO、gN等糖蛋白基因和儿童HCMV感染临床特点的相关[11-13]。gH基因多态性与临床疾病的关系研究相对较少，Paradowska等[4]研究发现，先天性感染HCMV gH1基因型增加了感觉神经性耳聋风险；研究显示，婴儿肺炎、肝炎综合征、无黄疸型肝炎等疾病中以gH1型感染为主，而ITP患儿以gH2型感染为主[3]。故本研究针对ITP患儿伴HCMV感染的gH基因分型做进一步讨论。

本研究ITP伴HCMV感染患儿中年龄＜1岁婴儿占90.2%，男性所占比例是女性的1.9倍。gH1和gH2两种基因型以gH1型多见，占63.4%，HCMV感染发病年龄、性别分布无差异。可见，儿童HCMV感染相关ITP病例以小婴儿、男性为主。

HCMV感染按发病时间可分为先天性（＜3周）、围生期（3周～3个月）、生后感染（≥3个月）。先天性HCMV感染是导致新生儿畸形的主要病因之一，临床表现为血小板减少、宫内发育延迟、婴儿肝炎综合征、小头畸形、中枢神经系统异常影像学表现（包括脑室增大、颅内钙化、脑室周围异常回声、皮层或小脑发育畸形），视网膜炎、感音性神经性耳聋等。本研究各组gH基因型分布无统计学差异。

近年来，在研究HCMV进入宿主细胞的机制中发现，HCMV在感染成纤维细胞（FB）和上皮细胞（EC）时是通过不同的进入途径发生的，这取决于不同的糖蛋白复合物抗原表位。HCMV进入FB时，需要gB和gH/gL/gO组成的糖蛋白复合物相互作用。HCMV进入EC过程中，除了依赖于 gB、gH/gL/gO，还需要由 gH、gL、UL128、UL130和UL131A组成的包膜五聚体复合物（PC）[14]，不同的包膜糖蛋白复合物分布差异，一定程度上决定了HCMV细胞嗜性不同，感染不同的组织细胞，导致临床表现及预后上的差异。gH是组成包膜糖蛋白复合物gH/gL/gO三聚体、PC的主要构成成分，其基因型的多态性是否可能导致包膜糖蛋白复合物分布不同，影响细胞嗜性尚不明确。本组研究中，ITP患儿出现的皮肤出血、发热、科室、腹泻、黄疸、肝肿大等临床症状的差异无统计学意义，gH基因型差异能否导致HCMV对不同组织细胞嗜性不同尚需扩大样本继续研究。

HCMV感染相关ITP的致病机制尚不明确，目前公认的是血小板自身抗体的产生，破坏血小板、损害骨髓巨核细胞或减少血小板的产生。也有些研究指出HCMV直接感染巨核细胞导致细胞病变、血小板生成减少[15]。说明部分常规免疫疗法无效的ITP可能存在不同的致病机制共同作用。目前对HCMV感染伴ITP患儿是否行抗病毒治疗尚有争议，区别在于以免疫介导效应为主，还是细胞病变效应为主，在治疗方案的选择上可能具有重要的治疗意义。从理论上讲，免疫介导效应对类固醇、免疫球蛋白治疗有反应，细胞病变效应对更昔洛韦治疗有反应。然而，在临床工作中很难区分这些效应。本研究中gH2型感染患儿3个月内血小板恢复率较gH1型低。另外，gH2型呈现高血小板抗体水平的病例较gH1型较高，但均无统计学差异。ITP患儿伴gH2型HCMV感染易出现持续的血小板降低，可能与产生高滴度的血小板抗体有关。gH1型巨核细胞产板功能异常比例较gH2型高，虽统计学无差异，可能提示ITP患儿伴gH1型HCMV感染倾向于影响骨髓巨核细胞功能，破坏产板功能。由于本研究样本量小，随访期短，gH分型对HCMV感染相关ITP临床表现相关性和预后的确切价值有待日后进行扩大样本量、延长随访期的研究进一步证实。

综上所述，ITP患儿伴HCMV感染的糖蛋白基因型以gH1型多见。ITP伴gH2型HCMV感染发展为持续性ITP可能性较大。