肾癌组织中原钙黏蛋白-10甲基化状态及临床意义

林英立 李艳丽 梁杰 赵炎

肾癌是泌尿系统中的常见肿瘤，占成人恶性肿瘤的2%～3%，在组织学上以透明细胞癌为主[1-2]。肾癌发生、发展的分子机制非常复杂，其中抑癌基因的失活起着重要作用。研究发现，表观遗传学改变在抑癌基因的失活过程中具有重要作用，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化和非编码RNA等；而DNA甲基化最为常见，可作为肿瘤早期诊断、疗效监测及预后判断的分子标志物[3-5]。原钙黏蛋白-10（PCDH10）是PCDH家族的一员，在细胞的正常生长发育过程中发挥着重要作用。肿瘤学研究表明，过表达的PCDH10具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用，DNA甲基化是PCDH10失活的主要因素[6-7]。本研究对肾癌组织中PCDH10甲基化状态及临床意义作一探讨。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2008年1月至2011年1月在本院接受肾癌根治术的78例肾癌患者为研究对象，其中男49例，女 29 例；年龄 55～78[66.5（61，72）]岁；参照 2010 年美国癌症联合委员会（AJCC）肾癌TNM分期：T138例，T217例，T320例，T43例；Fuhrman分级：G131例，G216例，G321例，G410例；局部淋巴结转移14例。纳入标准：（1）首次发现肾癌；（2）单一肾癌，未合并其他肿瘤；（3）术前影像学检查诊断为肾脏恶性肿瘤，术后组织病理学诊断为透明细胞癌；（4）术前未接受过任何形式的抗肿瘤治疗。所有患者随访至术后60个月或死亡，排除未能完成随访者。本研究经医院伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。

1.2 标本收集 收集78例肾癌患者的癌组织标本及其中38例T1期患者癌旁正常肾组织标本（距离肿瘤边缘2cm外）。所有标本在术中切取，迅速置于液氮中，存于-80℃冰箱内备用。

1.3 DNA提取与甲基化特异性PCR（MSP） 使用Dneasy Tissue Kit（69504，德国Qiagen公司）并严格按照说明书提取组织DNA。按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit（D5005，美国Zymo Research公司）试剂盒说明进行DNA亚硫酸氢钠修饰并纯化，分别应用甲基化和非甲基化引物进行PCR。甲基化引物：PCDH10正义5′-TCGTTAAATAGATACGTTACGC-3′，PCDH10 反义 5′-TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG-3′；非甲基化引物：PCDH10 正义 5′-GTTGTTAAATAGATATGTTATGT-3′，PCDH10 反义 5′-CTAAAAACTAAAAACTTTCCACA-3′。反应条件：95℃预变性5min；再进行35个循环的扩增反应，反应程序为 95℃变性 30s，60℃退火 1min，72℃延伸30s；然后72℃延伸10min；最后4℃保温[8-9]。反应结束后取10μl产物，用2%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像分析系统照相，结果以是否出现特异性甲基化或非甲基化条带表示。仅应用甲基化引物扩增出产物条带判断为存在完全DNA甲基化，仅应用非甲基化引物扩增出产物条带判断为不存在DNA甲基化，若同时出现扩增产物条带则表明存在部分DNA甲基化；完全DNA甲基化和部分DNA甲基化均被认为DNA甲基化阳性[8-9]。

1.4 统计学处理 应用SPSS 8.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用log-rank检验比较患者5年总生存率。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌组织与癌旁正常组织中PCDH10甲基化阳性率比较 肾癌组织PCDH10甲基化阳性率为73.1%（57/78），明显高于癌旁正常组织的 21.1%（8/38），差异有统计学意义（P＜0.05）。肾癌组织PCDH10甲基化状态的电泳图，见图1。

图1 肾癌组织PCDH10甲基化状态的电泳图（例55、56、57出现甲基化；例58、59未出现甲基化；M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 肾癌组织PCDH10甲基化状态与患者临床特征的关系 肾癌组织PCDH10甲基化阳性与患者性别、年龄无关，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与肿瘤T分期、Fuhrman分级、淋巴结转移有关，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 2。

表2 肾癌组织PCDH10甲基化状态与患者临床特征的关系[例（%）]

2.3 肾癌组织PCDH10甲基化与患者5年总生存率的关系 78例肾癌患者中，肾癌组织PCDH10甲基化57例，PCDH10非甲基化21例。甲基化组5年总生存率为73.7%（42/57），明显低于非甲基化组的95.2%（20/21），差异有统计学意义（P＜0.05），生存曲线见图2。

3 讨论

PCDH10基因位于人类染色体4q28.2，早期研究认为其主要在神经系统中表达，参与神经发育、细胞识别和神经通路的形成等。但近年来研究发现，PCDH10在成人正常组织中广泛表达，且在肿瘤组织中表达减少或缺失，对多种肿瘤具有抑癌基因的功能[6,10-11]。抑癌基因的失活具有多种机制，包括杂合性缺失、单倍体不足、基因印记、多态性和DNA甲基化等[12-13]。

图2 肾癌组织PCDH10甲基化与未甲基化患者5年总生存率的生存曲线

DNA甲基化是最常见的一种表观遗传学改变。本研究所采用的MSP是目前应用最广泛的甲基化检测方法，具有较高的灵敏度和特异度[14-15]。为研究PCDH10甲基化与肾癌发生的关系，笔者检测了PCDH10在肾癌组织和癌旁正常肾组织中的甲基化状态，结果发现PCDH10在肾癌组织中的甲基化阳性率明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义，提示PCDH10甲基化与肾癌的发生密切相关。一项基础研究显示，在肝癌细胞中上调PCDH10表达能抑制PI3K/Akt通路，进而促进细胞的凋亡，抑制细胞增殖[10]；在多发性骨髓瘤的基础研究中，也发现了PCDH10抑制细胞增殖的现象[11]。DNA甲基化是PCDH10表达下调的主要原因。

有研究发现在乳腺癌、前列腺癌组织中PCDH10甲基化与患者肿瘤大小、分级和转移等密切相关，PCDH10甲基化是肿瘤进展的促进因素[7，9]。为探讨肾癌组织PCDH10甲基化的临床意义，笔者分析了PCDH10甲基化与患者性别、年龄、肿瘤T分期、Fuhrman分级和淋巴转移的关系，结果发现在T分期及Fuhrman分级较高、有淋巴转移的患者中，PCDH10甲基化明显增加。可见，PCDH10甲基化与肾癌的发生、发展密切相关。关于肾癌的预后，目前尚缺乏有效的预测指标，主要依靠临床分期来预测患者的生存率，但其准确性不能满足临床的要求。精确区分哪些患者在手术治疗后预后较差、需要进一步治疗是目前临床上急需解决的问题。为进一步探讨肾癌组织PCDH10甲基化与患者预后的关系，笔者对肾癌患者进行了5年术后随访，结果发现PCDH10甲基化组5年总生存率明显低于未甲基化组，提示肾癌组织PCDH10甲基化阳性与患者预后不良有关；这与乳腺癌、前列腺癌和淋巴瘤中的研究结果相似[7-8,16]。

综上所述，肾癌组织PCDH10甲基化阳性率较高，与肾癌的发生、发展及患者预后不良相关。PCDH10甲基化指标有可能成为肾癌诊断与预后预测的分子标志物。