ATP合酶在糖尿病大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞病变中的作用机制

武志刚 徐自强 陈纪豪 萧云备 蔡健 张磊

近年来，各种因素导致的糖尿病患者逐年增多。勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是男性最常见的性功能障碍，其作为男性糖尿病患者的首要并发症，受到越来越多的关注。1992年美国国立卫生研究院专家会议确定，糖尿病是男性性功能障碍的重要病因[1]。当前，5型磷酸二酯酶抑制剂作为一线治疗ED的药物，已被广泛认可。糖尿病ED，主要是糖尿病引起的阴茎海绵体功能受损所致，目前尚缺乏有效的治疗手段。阴茎海绵体平滑肌功能的调整是一个非常复杂的过程。一般来说，许多部位的平滑肌细胞功能取决于线粒体。因此，阴茎海绵体平滑肌功能障碍与线粒体功能障碍之间存在密切联系[1-2]。长期高血糖环境会使线粒体的功能发生变化，包括二磷酸腺苷/三磷酸腺苷（ADP/ATP）升高、超微结构改变、活性氧过量生成等，这些变化会严重损害阴茎海绵体平滑肌伸缩、舒展等生理功能。当ATP合酶出现功能障碍（尤其是F1-ATP合酶出现问题）时，线粒体产生的ATP大量减少，会导致稳态失衡，使人体出现一系列疾病，其中包括ED[3-4]。到目前为止，ATP合酶与糖尿病ED之间的关系尚不清楚，故本研究通过大鼠体内及体外实验，建立糖尿病模型，采用胶原纤维（Masson）染色和免疫组化法观察大鼠阴茎海绵体纤维化及平滑肌细胞凋亡情况[半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）被证实处于Caspase级联反应的下游，通过降解细胞内相应底物使细胞凋亡]，采用Western blot法观察平滑肌细胞转化生长因子β1（TGF-β1）通路上蛋白表达，以探讨阴茎海绵体平滑肌中F1-ATP合酶的表达是否受高葡萄糖环境的影响，以及对勃起功能是否存在改善作用。

1 材料和方法

1.1 体内试验

1.1.1 动物及试剂 40只无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠，200～250g，2月龄，由广东省医学实验动物中心提供，许可证编号：SYXK（粤）2013-0002；经交配实验证实均有正常性功能。阿扑吗啡（APO，Z100839）由中国药品生物制品检定所提供，BCA蛋白浓度定量试剂盒（#23225）购自美国 Pierce公司，Anti-F1 ATPase（NBP1-91573）购自美国 Novusbio公司，Anti-GAPDH-HRP（KC5G5）购自上海康成公司，Goat anti-rabbit IgG（H&L）-HRP（AP307P）购自美国 Millpore公司，Caspase-3 免疫组化染色试剂盒（KGA108）购自南京凯基生物公司。

1.1.2 动物分组及模型制备 将40只SD大鼠按简单随机分组法分为正常对照组16只、糖尿病组24只。所有大鼠适应性饲养3d后，禁食不禁水12h。糖尿病组按60mg/kg腹腔注射链脲佐菌素，于72h、1周、2周时割尾法采血测量血糖，以随机血糖水平＞16.7mmol/L为糖尿病动物建模成功标准。造模期间及造模成功后，两组大鼠均采取正常饮食。

1.1.3 阴茎勃起功能检测 采用阴茎勃起功能实验。糖尿病组与正常对照组大鼠饲养10周后，按100μg/kg剂量皮下注射APO。在安静、灯光调暗环境下观察并记录30min内大鼠勃起次数（以龟头充血及阴茎体增长为阴茎勃起1次）。

1.1.4 大鼠阴茎组织获取及处死 于阴茎勃起功能检测后，两组大鼠按40mg/kg予1%戊巴比妥麻醉后，取阴茎组织样本用于检测；再使用过量戊巴比妥腹腔注射处死大鼠。

1.1.5 阴茎海绵体组织纤维化观察 采用Masson染色法。糖尿病组与正常对照组大鼠麻醉后，取阴茎根部海绵体组织常规石蜡包埋、切片（厚4μm）、脱蜡、水化，按照Masson染色的标准作进一步处理后，加盖玻片，在光镜下观察阴茎海绵体组织纤维化情况，并拍照。

1.1.6 阴茎海绵体F1-ATPase蛋白表达水平检测 采用Western blot法。从大鼠阴茎的平滑肌细胞中提取蛋白质，按照BCA蛋白浓度定量试剂盒说明进行蛋白定量检测。将等量（40mg/泳道）的蛋白质提取物在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。用5%脱脂牛奶封闭后，将膜与以下一抗在4℃下孵育过夜，即F1-ATPase（Novusbio，1∶1 000）、GAPDH（Abcam，1∶1 000）；再与二抗孵育。抗体在室温下保持2h。使用增强化学发光法（ECL）对条带进行可视化，并使用Image-J软件分析所得图像。

1.1.7 阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡检测 采用免疫组化法。取阴茎海绵体石蜡标本切片（厚4μm），检测阴茎海绵体平滑肌细胞Caspase-3表达。按照试剂盒说明予相应的抗体，显色后在显微镜下观察两组大鼠阴茎海绵体Caspase-3阳性的平滑肌细胞比例。

1.2 体外试验

1.2.1 主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自美国Thermo Scientific公司，微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒Ⅰ型均购自中美泰和公司，TaKaRa Taq Max购自康为生物公司，TGF-β1、结缔组织生长因子（CTGF）免疫组化试剂盒均购自美国Bioworld Technology公司。

1.2.2 细胞分离、培养及转染 取正常对照组大鼠3只，分离阴茎海绵体组织，将组织剪成约（0.5×1.0×1.0）mm3小块，PBS漂洗2次，置入涂有20%FBS的25ml无菌培养瓶内，加入2ml含各种氨基酸和葡萄糖的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。3d后在显微镜下看到少量平滑肌细胞自组织爬出，清除组织块，继续培养至传代。将Atp5b合成基因（由上海生工公司提供）克隆到pcDNA3.1（+）载体中。根据说明书进行细胞转染。最后将细胞分为对照组（正常的培养基培养阴茎海绵体平滑肌细胞）、高糖组（含有高葡萄糖30mmol/L的培养基培养阴茎海绵体平滑肌细胞）、高糖+ATP酶过表达组（ATPase高表达质粒转染阴茎海绵体平滑肌细胞24h后，再用含有高葡萄糖30mmol/L的培养基培养海绵体平滑肌细胞）。

1.2.3 F1-ATPase、TGF-β1和CTGF蛋白表达水平检测采用Western blot法。从平滑肌细胞中提取蛋白质，按照BCA蛋白浓度定量试剂盒说明进行蛋白定量。将等量（40mg/泳道）的蛋白质提取物在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到PVDF膜上。封闭后，与一抗F1-ATPase（1∶1 000）、TGF-β1（1∶1 000）、CTGF（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 000）孵育过夜，然后与二抗孵育。使用ECL对条带进行可视化，并使用Image-J软件分析所得图像。

1.3 统计学处理 应用SPSS 21.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病组与正常对照组大鼠体重及血糖浓度比较 开始建模2周后，糖尿病组大鼠体重为（188.93±1.26）g，较正常对照组的（228.00±2.08）g明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。建模72h后，糖尿病组大鼠血糖浓度为（17.35±0.16）mmol/L，提示造模成功；建模 2周后，糖尿病组血糖浓度为（20.66±1.09）mmol/L，较正常对照组的（6.87±0.26）mmol/L明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 1。

图1 糖尿病组与正常对照组大鼠链脲佐菌素注射前后血糖浓度比较

2.2 糖尿病组与正常对照组大鼠阴茎勃起功能比较 注射APO后，糖尿病组大鼠30min内阴茎勃起（3.43±0.50）次，较正常对照组的（0.21±0.41）次明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），图 2。

图2 糖尿病组与正常对照组大鼠30min内阴茎勃起次数比较（与正常对照组比较，*P＜0.05）

2.3 糖尿病组与正常对照组大鼠阴茎海绵体纤维化比较 与正常对照组比较，糖尿病组大鼠阴茎海绵体组织胶原纤维面积相对增加，肌纤维面积相对减少，见图3（插页）；糖尿病组大鼠胶原纤维/肌纤维比例为3.06±0.59，较正常对照组的1.76±0.40明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。提示糖尿病组大鼠阴茎海绵体组织纤维化程度加重。

图3 光镜下大鼠阴茎海绵体组织纤维化观察（a：正常对照组；b：糖尿病组；Masson 染色，×100）

2.4 糖尿病组与正常对照组大鼠阴茎海绵体Caspase-3阳性的平滑肌细胞比例比较 糖尿病组大鼠阴茎海绵体Caspase-3阳性的平滑肌细胞比例为（34.8±2.0）%，较正常对照组（12.2±1.8）%明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），免疫组化染色结果见图5（插页）。提示持续高血糖可以促进阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡。

2.5 体内外实验观察细胞内F1-ATPase蛋白表达变化糖尿病组大鼠阴茎海绵体F1-ATPase蛋白表达水平为0.93±0.33，明显低于对照组的1.42±0.23，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6a。体外实验发现，高糖组大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞内F1-ATPase蛋白表达水平为0.51±0.03，较对照组1.25±0.13明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；高糖+ATP酶过表达组细胞内F1-ATPase蛋白表达水平为1.01±0.12，较高糖组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6b。

图4 糖尿病组与正常对照组大鼠组织胶原纤维/肌纤维比例比较（与正常对照组比较，*P＜0.05）

图5 显微镜下大鼠阴茎海绵体Caspase-3阳性的平滑肌细胞观察（a：正常对照组；b：糖尿病组；免疫组化染色，×100）

图6 大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞内F1-ATPase蛋白表达的电泳图（a：体内实验；b：体外实验）

2.6 体外实验观察TGF-β1通路上蛋白表达变化 体外实验发现，高糖组大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞内TGF-β1、CTGF 蛋白表达水平分别为 0.080 7±0.001、0.275 4±0.014，均较对照组的 0.037 1±0.001、0.085 5±0.008明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；高糖+ATP酶过表达组细胞内TGF-β1、CTGF蛋白表达水平分别为 0.063 7±0.003、0.228 0±0.009，均较高糖组明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图7。提示阴茎海绵体平滑肌细胞线粒体功能恢复可以抑制平滑肌细胞纤维化的发展。

图7 大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞内TGF-β1通路上蛋白表达的电泳图

3 讨论

我国一项关于北京、广州及重庆等3个城市2 226例成年男性的调查结果显示，ED总患病率为26.1%，40岁以上男子的患病率为40.2%[5]。一些疾病会导致ED的发生，其中最常见的是糖尿病。资料显示，糖尿病ED发病率是非糖尿病患者的1.9～4倍，各国报道的糖尿病ED发病率为20%～75%，且随着年龄增长、糖尿病病程延长而逐渐升高，其中年龄＞45岁、糖尿病病程＞10年者，ED表现更明显[6]。长期的糖尿病ED，会使患者产生焦虑、自卑、失败感等情绪。

糖尿病与ED关系密切，但其具体机制尚未完全阐明。目前一般认为阴茎海绵体内的血管、神经、激素、内皮功能紊乱是糖尿病ED的主要病因。正常阴茎海绵体平滑肌细胞含量为40%～50%，是维持阴茎正常勃起功能的重要细胞；但糖尿病患者往往代谢紊乱，会使其全身大动脉发生粥样硬化或血管乃至微血管病变，从而引起阴茎海绵体缺血、缺氧，使得阴茎海绵体平滑肌细胞数量减少、纤维化程度增加，同时发生阴茎海绵体白膜纤维减少，最终促使糖尿病ED发生、发展。目前已有动物试实验证实，阴茎海绵体纤维化是糖尿病导致阴茎海绵体结构改变的主要表现[3]。阴茎海绵体纤维化病变机制非常复杂，一方面是高血糖状态导致TGF-β1信号通路（调控阴茎海绵体纤维化的关键环节及主要通路）激活[7-9]，其可能机制包括：（1）TGF-β1通过延长细胞周期G2期，抑制阴茎海绵体平滑肌细胞增殖；（2）上调TGF-β1通路，促进阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡；（3）TGF-β1可以使海绵体内细胞外基质中纤维连接蛋白及胶原Ⅳ型蛋白形成增加，从而引起阴茎海绵体纤维化[10]。另一方面是糖尿病导致机体代谢功能紊乱，从而引起的阴茎海绵体平滑肌细胞舒张功能异常，这是关键一环，与ATP合酶及ATP密切相关。

ATP合酶是一种广泛存在于真核生物中且与能量代谢相关的关键酶。该酶主要位于线粒体内膜上，参与氧化磷酸化与光合磷酸化反应，在跨膜质子动力势的推动下催化合成生物体的能量“通货”——ATP。ATP主要为人类生理活动提供能量，当ATP合酶功能障碍时，线粒体产生ATP大量减少，会导致人体正常生理功能紊乱，甚至危及生命。糖尿病是一种以慢性高血糖为特征、多病因共同作用引起的代谢性疾病[11]。慢性血糖升高将引起人体微血管、大血管及神经系统病变，而长期处于高血糖环境会影响阴茎海绵体血管、神经，进而出现阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡及阴茎组织纤维化，最终引起ED。目前动物实验结果表明，通过胰岛移植控制糖尿病大鼠血糖状态，可以改善阴茎海绵体纤维化状态，从而恢复一定的勃起功能，但是否与ATP合酶途径有关尚需进一步研究证实[12]。相关文献报道，高血糖诱导ED的机制可能是阴茎海绵体平滑肌中蛋白激酶B（Akt）磷酸化途径受阻导致ATP合酶降低[13]。可见，ATP合酶对维持高血糖患者阴茎海绵体平滑肌功能是必需的。本研究采用链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型，喂养10周后发现糖尿病ED大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中F1-ATPase蛋白表达明显降低。持续高糖状态可以导致平滑肌细胞内ATP合酶活性降低，线粒体功能出现紊乱，进而影响阴茎海绵体平滑肌功能，导致ED发生。阴茎海绵体纤维化是ED发生、发展的一个重要原因。线粒体功能与组织纤维化密切相关。有研究发现，通过恢复糖尿病大鼠细胞内线粒体功能、上调ATP合酶活性，可以抑制肾脏纤维化发展[14]。因此，笔者在体外高葡萄糖条件下上调阴茎海绵体平滑肌细胞内ATP合酶的表达，同时观察到高糖环境下平滑肌细胞内线粒体功能恢复，且TGF-β1及其下游的效应因子CTGF表达明显降低。笔者推测，通过调控阴茎海绵体平滑肌细胞中ATP合酶的活性可以抑制TGF-β1途径，延缓阴茎海绵体平滑肌纤维化。

综上所述，高糖状态会导致阴茎海绵体纤维化，促进阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡。通过线粒体ATP合酶的上调，可以抑制TGF-β1途径，改善阴茎海绵体平滑肌纤维化程度，恢复平滑肌的功能，促使阴茎勃起功能得到改善。ATP合酶可能是糖尿病ED调节的关键因子，本研究为糖尿病ED治疗新靶点的探索奠定了新的理论及实验基础。