CD200在大肠癌干细胞中的表达及其与患者细胞免疫水平的相关性研究

彭伯坚，周永健，张园，张险峰，张拥军，曹天生，李瑜元

大肠癌主要包括结肠癌和直肠癌两种，其发病率从高到低依次为：直肠、乙状结肠、盲肠等，且疾病发生率呈逐年上升趋势[1]。目前，临床上对于大肠癌发病机制尚不完全知晓，普遍认为与生活方式、遗传、大肠腺瘤等有关，男性发病率略高于女性，发病早期临床症状缺乏特异性，部分患者仅伴有不适、消化不良及大便潜血等，随着病情的不断发展，常伴有腹部包块、肠梗阻等，影响患者健康及生活[2-3]。因此，加强大肠癌临床诊断、治疗对改善患者预后具有重要的意义。CD200是一种广泛表达于多种免疫、炎症相关细胞上的跨膜糖蛋白，具有免疫调节作用，多与树突状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤淋巴细胞表面受体相互作用，从而发挥免疫抑制效应[4-5]。国内学者研究表明[6-7]：CD200在多种实体瘤、血液系统肿瘤干细胞上均有表达，且CD200的表达水平与肿瘤预后存在紧密的联系。因此，本文采用随机对照方法进行研究，探讨CD200在大肠癌干细胞中的表达及其对患者细胞免疫水平的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2015年4月至2017年5月广东省广州市花都区人民医院收治的大肠癌患者58例作为研究对象，根据手术效果将患者分为完全缓解组(病灶切除，近6个月未见复发)和未缓解组(病灶切除但出现复发或病灶未能全部切除，病情持续发展)。完全缓解组42例，男32例，女10例，年龄34～79岁，平均(56.74±5.67)岁；肿瘤直径3～14 cm，平均(7.45±1.21)cm；浸润深度：肌层25例，浆膜及浆膜外17例；分化程度：低分化11例，中分化19例，高分化12例；淋巴结转移24例，未转移18例。未缓解组16例，男9例，女7例，年龄35～80岁，平均(55.93±5.71)岁；肿瘤直径3～15 cm，平均(7.51±1.23)cm；浸润深度：肌层11例，浆膜及浆膜外5例；分化程度：低分化6例，中分化7例，高分化3例；淋巴结转移11例，未转移5例。两组性别、年龄、肿瘤直径、浸润深度及分化程度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究获广东省广州市花都区人民医院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 纳入、排除标准

1.2.1 纳入标准 ①符合大肠癌临床诊断标准[8-9]，均经手术组织检查获得确诊；②符合手术治疗适应证，术中均取病灶组织5 cm3；③对患者所有检查、手术均在医嘱下完成。

1.2.2 排除标准 ①大肠癌发生转移或预计生存期<3个月；②符合手术治疗适应证但是手术过程中伴有严重并发症者；③合并高血压、糖尿病、慢性乙型肝炎等慢性疾病者。

1.3 方法

1.3.1 大肠癌干细胞的分离、制备

①分离制备方法。所有患者均行手术治疗，取大肠癌病灶组织，采用差速离心法完成大肠癌干细胞分离、培养。将手术过程中获取的大肠病灶组织，将其放在装有含体积分数为10.0%胎牛血清DMEM培养液中，5 min浸泡，PBS反复冲洗后去除脂肪等组织利用10 mL注射器抽取含有10.0%胎牛血清的培养基，20 min离心，速度4 500 rpm，离心半径60 cm，完毕后利用吸管轻轻吹打手机的细胞，搜集沉淀，加入10 mL生理盐水进行重悬沉淀。对悬液进行二次离心，离心速度为500 rpm，离心5 min，加入10 mL生理盐水，以1.0×106cells/mL密度接种在培养瓶中，放置在37 ℃，浓度5% CO2培养箱中，48 h后全量换液一次，完成大肠癌干细胞的分离[10]。②细胞鉴定。根据细胞的形态、生长曲线及流式细胞仪完成大肠癌干细胞鉴定，获得的干细胞为大肠癌干细胞[11]。

1.3.2 CD200细胞数的测定

取上述采集的大肠癌干细胞，15 min离心，速度4 000 rp，采用流式细胞仪测定两组细胞中表达CD200的细胞数。取上述分离、制备的大肠癌干细胞2×106/mL中，加入24孔培养板中，每孔1 mL，加入20 μg/L佛波酯、1 mg/L离子霉素及2 μmol/L莫能菌素，将其放置在37 ℃ 浓度为5% CO2培养箱中进行培养，设置同型对照管和实验管，各加入10 mL CD3-APC和CD4-FITC抗体，避光室温下孵育30 min。洗涤后去除上层清液，采用浓度为4%多聚甲醛进行固定，常温下放置20 min。采用浓度为0.1%皂素进行10 min穿膜，去除上层清液后每管留穿膜液重悬细胞200 μL；向实验管中加入10 μL Foxp3抗体，避光下进行1 h孵育，洗涤后重悬细胞500 μL后放入流式细胞仪上测定[12-13]。

1.3.3 炎症因子检测

两组手术前、手术后次日早晨取空腹静脉血5 mL，15 min离心，速度4 500 rpm，血清分离完毕后采用酶联免疫吸附试验测定两组白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-4(IL-4)及干扰素-γ(INF-γ)水平、白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子β1(TGF-β1)，操作步骤均在仪器、试剂盒说明书下完成。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 大肠癌干细胞鉴定

倒置显微镜下结肠癌干细胞接种在胎牛血清10.0%培养基中，第3天仍可见干细胞球，多数细胞悬浮生长，部分细胞从细胞求中逸出呈梭形；第7天多数干细胞贴壁生长，呈梭形；第9天干细胞全部转化为梭状大肠癌干细胞，且贴壁生长，流式细胞仪测定结果表明：结肠癌干细胞表面标志物CD200细胞群含量达到80.3%(红线所示)，见图1。

图1大肠癌鉴定结果 A：干细胞第三天倒置显微镜下结果；B：大肠癌干细胞第7天倒置显微镜下结果；C：第9天干细胞倒置显微镜结果；D：流式细胞图

2.2 完全缓解组和未缓解组CD200表达水平比较

完全缓解组CD200表达水平为(3.12±0.43)%，显著低于未缓解组的(5.69±0.56)%，差异有统计学意义(t=12.195,P=0.000)。

2.3 两组治疗后炎症因子水平比较

完全缓解组IL-17、INF-r、IL-10及TGF-β1水平，均高于未缓解组(P<0.01)；完全缓解组IL-4水平，低于未缓解组(P<0.01)，见表1。

表1 两组治疗后炎症因子水平比较

2.4 大肠癌干细胞CD200表达与细胞免疫水平相关性分析

大肠癌干细胞CD200表达与FoxP3+/CD4+、IL-4呈正相关性(P<0.05)；大肠癌干细胞CD200表达与IL-17、INF-γ、IL-10及TGF-β1水平呈负相关性(P<0.05)；见表2。

表2 大肠癌干细胞CD200表达与细胞免疫水平相关性分析

3 讨论

大肠癌肿瘤干细胞的存在与演变是肿瘤发生、转移、复发及发展的主要原因，该细胞有别于普通癌细胞，具有自我更新、无限分化潜能，也是临床上大肠癌治疗失败的根本原因[16]。国内学者研究表明，大肠癌的发生、发展是一个多因素过程，常伴有机体免疫系统与肿瘤细胞之间的相互作用，免疫系统通过重塑肿瘤细胞抗原性，能影响机体免疫功能的正常发挥[17-18]。本研究以大肠癌患者作为对象，通过切除病灶组织、分离获得大肠癌干细胞，在倒置显微镜下将大肠癌干细胞接种于10.0%胎牛血清的培养基中，第3天仍可见干细胞球，多数细胞悬浮生长，部分细胞从细胞求中逸出呈梭形；第7天多数干细胞贴壁生长，呈梭形；第9天干细胞全部转化为梭状大肠癌干细胞，且贴壁生长。流式细胞仪测定结果显示，结肠癌干细胞表面标志物CD200细胞群含量达到80.3%。由此可见，分离制备的干细胞为大肠癌干细胞，能为本研究顺利进行奠定基础。

CD200是一种I型膜糖蛋白，是高度保守的免疫球蛋白超家族成员，能在人类多种细胞中表达，包括胸腺细胞、血管内皮细胞、肾小球细胞、嗜酸性粒细胞等[19-20]。同时，CD200还可以在B细胞、T细胞中表达，能通过髓系细胞表面的受体结合影响细胞功能，从而发挥免疫调节作用[21-22]。本研究中，大肠癌患者中完全缓解组CD200表达水平低于未缓解组(P<0.05)。由此可见，CD200在大肠癌患者中呈高表达，有助于评估患者治疗预后。国内学者研究显示， 表达CD200的大肠癌肿瘤干细胞能促进肿瘤的生长，提高癌细胞活性，实现肿瘤细胞的自我更新、转移，致使肿瘤干细胞继续生长、发展[23-24]。同时， 表达CD200的大肠癌肿瘤干细胞能保持肿瘤生长的全能性，可通过免疫机制逃避机体的免疫监视，从而提高免疫耐受作用。因此，加强大肠癌干细胞CD200的检测能为临床制定有效的措施降低肿瘤的复发率提供依据和参考[25-26]。

大肠癌的发生、发展是一个多因素过程，常伴有免疫水平的变化及炎症因子的共同参与。临床上，根据分泌细胞因子不同将辅助性T淋巴细胞分为Th0、Th1、Th2及Th3四种不同的类型，而在人体中主要以Th1、Th2为主[27]。国内学者研究表明，Th1细胞主要分泌IL-2和IFN-γ等，能介导细胞毒作用，其表达水平与机体局部免疫应答有关，能辅助相关抗体的生成，直接参与细胞免疫。而大肠癌患者体内分泌的IL-2和IFN-γ量相对较多，将进一步增强细胞毒性。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等炎症因子，其表达水平多与体液免疫水平有关[28]。对于正常人而言，Th1与Th2处于一个动态平衡，共同维持机体细胞免疫与体液免疫[29]。但是，大肠癌患者由于癌细胞的持续增殖、生长，导致机体的免疫平衡被打破，且患者经过积极有效的手术、化疗治疗后，将会造成细胞毒性进一步削弱，引起免疫监视缺失，加剧疾病的发生、发展。本研究结果显示，完全缓解组IL-17、INF-γ、IL-10及TGF-β1水平均高于未缓解组(P<0.05)；完全缓解组IL-4水平低于未缓解组(P<0.05)。提示大肠癌患者常伴有免疫水平失衡，影响患者预后。为提高大肠癌临床治疗效果，本研究进一步分析了患者大肠癌干细胞CD200表达阳性率与机体免疫水平的相关性。SPSS Pearson相关性分析结果表明，大肠癌干细胞CD200表达水平与FoxP3+/CD4+、IL-4呈正相关(P<0.05)；CD200在大肠癌干细胞中表达水平与IL-17、INF-r、IL-10及TGF-β1水平呈负相关(P<0.05)。由此可见，CD200在大肠癌干细胞中呈高表达，并且与肿瘤细胞免疫水平之间存在明显的相关性。因此，对于确诊的大肠癌患者，应及时采取有效的措施进行治疗、干预，治疗过程中加强患者CD200测定，评估患者预后，指导临床治疗，善于根据CD200检测结果调整治疗方案，使得患者的治疗更具科学性[30]。

综上所述，CD200在大肠癌干细胞中呈高表达，且与肿瘤细胞免疫水平具有一定的相关性，加强CD200表达水平测定评估、预测疾病严重程度，可指导临床治疗，值得推广应用。