肠黏膜紧密连接蛋白变化与癌性恶病质患者细菌易位相关性研究

望小杰,李峰,谢勤文,尹佳欢,王勇

癌症恶病质可能引起患者基础代谢水平升高，并增加机体对常规营养支持干预的抵抗。细菌易位(bacterial translocation，BT)指本处于肠腔之中的细菌，渗透肠黏膜屏障，进入人体肠系膜淋巴结以及门静脉系统，最终进入体循环系统与肝脾肺等部位的过程。多项研究指出，大部分危重患者感染均因肠源性微生物所致，肠黏膜屏障损伤以及免疫力低下为引起BT发生主要条件[1-3]。亦有报道称，BT可能会促进癌症恶病质发生以及发展[4]。BT被认为是人体肠道定植细菌或相关产物经肠黏膜屏障后至肠系膜淋巴结或者远处部位通道。而细菌及蛋白易位发生通道处于细胞膜，肠黏膜屏障功能重要部位为肠上皮细胞相应紧密连接部。本文以160例结肠癌手术患者为研究对象，探讨肠黏膜紧密连接蛋白变化与癌性恶病质患者BT相关性，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象

选取2005年1月至2015年1月罗店医院和上海第九人民医院收治的160例结肠癌手术患者，纳入标准：①电子结肠镜及病理检查显示结肠癌；②具有手术适应症，同意手术；③对研究知情，签署知情同意书。排除标准：①存在腹部闭合性损伤史或者腹部手术史；②入院前2周予以全肠外营养支持；③术前2周内接受抗生素治疗；④有证据显示腹腔受到感染或污染；⑤无法获取淋巴结者。按照是否伴恶病质分为恶病质组(92例)与不伴恶病质组(68例)。两组性别、年龄及肿瘤位置等一般资料比较无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法

(1)细菌制备：于手术治疗无菌条件下以及抗生素使用前，取患者回盲部淋巴结2枚，予以有氧以及无氧培养，控制温度37 ℃持续培养48 h。将结肠切除后，需要立即剖开肠腔顺利获取粪便，然后制作组织均浆，置于麦康凯琼脂里面，于37 ℃条件下培养24 h。

(2)鉴定细菌形态：由所培养每份粪便标本里面随机选择四种大肠埃希菌(注意99%概率和淋巴结之内易位细菌同源)，采取API 20E试条证实大肠埃希菌和淋巴结来源的相应大肠埃希菌具有一致形态。

(3)确定BT情况：采取DNA指纹图谱进行分析，确定淋巴结内部细菌是否属于肠道易位细菌。为证实肠系膜淋巴结之中细菌源于肠道，可以首先采取肠杆菌基因间保守重复序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC)-PCR法，然后以基因外重复回文序列(repetitive extragenic palindromic，REP)-PCR法予以进一步验证。

(4)分离并且培养肠黏膜细胞，以蔗糖密度梯度超速离心法进行膜脂肪微区的分离，通过Western blotting、蛋白质双向电泳以及蛋白质指纹图谱进行该区域紧密连接蛋白(包括Occludin、Claudin、ZO-1)的表达分析。

1.3 观察指标

比较恶病质组与不伴恶病质组BT发生率；将恶病质组患者分为BT组与非BT组，比较两组肠黏膜紧密连接蛋白(Occludin、Claudin、ZO-1)的表达情况。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 恶病质组与不伴恶病质组BT发生率比较

恶病质组BT患者25例，BT发生率27.17%，不伴恶病质组BT患者6例，BT发生率8.82%；恶病质组BT发生率明显高于不伴恶病质组(2=8.429，P=0.004)。

2.2 BT组与非BT组肠黏膜紧密连接蛋白表达比较

BT组Occludin、ZO-1蛋白表达明显低于非BT组(P<0.05)，Claudin蛋白表达明显高于非BT组(P<0.05)，见表2、图1。

表2 BT组与非BT组肠黏膜紧密连接蛋白表达比较

图1BT与非BT肠黏膜紧密连接蛋白表达Western blotting结果图谱

3 讨论

结肠癌属于消化系统常见恶性肿瘤，好发于40～50岁群体[5]。在现代人民生活水平不断提高以及饮食结构日益改变背景下，我国大肠癌临床发病率呈现逐年增高趋势，然而早期诊断率却低于15%，大部分患者确诊时已发展至中晚期，大肠癌具有较高恶病质风险[6]。当前，临床尚无明确恶病质具体发病机理，且亦无有效治疗对策。虽然营养不良属于恶病质主要表现，然而大部分患者在进食没有减少情况下，已产生恶病质，予以单纯营养支持无法改善营养不良状态，无法治愈恶病质。相关研究指出，抗促炎因子治疗可以增加小鼠体内瘦肉质群，获得改善恶病质效果[7]。亦有研究表明，采取OMEGA-3脂肪酸进行抗炎治疗，能够改善恶病质患者营养不良状态[8]。故临床普遍认为，恶病质的出现和患者炎性反应存在紧密联系。但是，大部分患者并未产生外源性感染灶。癌性恶病质患者炎性反应是一个慢性过程，其和急性感染有较大差异：恶病质患者未产生高热症状，甚至大部分患者亦无低热症状，体内仅产生某些细胞因子(包括白介素1、白介素8等)水平升高现象，为持续并且小剂量炎性刺激所致，内源性感染(即BT)可能发挥了重要作用[9]。本研究推测：恶性肿瘤患者免疫功能均呈不同程度降低表现，肠黏膜屏障功能较为容易受损(特别是大肠癌)，易引起BT，而BT能够诱发机体炎性反应，促使机体脂肪代谢、肌肉损耗与代谢障碍等发生。BT和细胞因子升高之间形成了恶性循环，长此以往，最终引发癌性恶病质[10]。对于癌性恶病质而言，其病因非常多，包括肿瘤所致消化道梗阻以及腹部手术后予以放化疗等，均存在一个共同特点：体内促炎细胞因子水平升高。多种炎症因子能够对肠上皮细胞屏障造成损害，使得肠黏膜通透性提升[11-12]。BT又能诱发机体炎性反应，导致促炎细胞因子水平升高[13-14]。相关报道指出，癌性恶病质病人在未产生外源性感染时，体内促炎细胞因子水平是升高的，同时相较于不伴恶病质者，其升高程度更大，表明两者之间存在一定内在联系[15-16]。本组研究中，恶病质组BT发生显著高于不伴恶病质组，与黄路桥等[17]研究结论相符。说明相较于不伴恶病质患者，伴恶病质结肠癌患者更容易出现BT。紧密连接通常存在于人体上皮细胞以及内皮细胞相应连接复合体里面，对维持肠黏膜屏障以及血管内皮稳定性发挥着重要作用。细胞因子分泌情况与BT之间互为因果，其中细胞因子分泌能够引起BT，而BT能够增加细胞因子分泌量[18-19]。一般情况下，大肠癌患者处于营养不良状态，免疫能力较弱，容易产生菌群失调现象，从而使肠黏膜屏障受损程度增加，提高BT风险[20]。肠黏膜紧密连接蛋白主要包括Occludin、Claudin、ZO-1等。本研究显示，BT组Occludin、ZO-1蛋白表达显著低于非BT组，Claudin蛋白表达显著高于非BT组，表明癌性恶病质患者发生BT时，Occludin、ZO-1蛋白表达明显降低，并且Claudin蛋白显著升高。

综上，肠黏膜紧密连接蛋白表达变化与癌性恶病质BT发生存在一定相关性，BT发生时，Occludin、ZO-1蛋白明显降低，而Claudin蛋白表达明显升高。