表没食子儿茶素没食子酸酯对斑块状银屑病患者Th1/Th2免疫平衡的影响

付丹丹 胡华 张孟杰 李敏 李占国 田中伟

新乡医学院第一附属医院皮肤性病科，河南卫辉 453100

银屑病的发病机制复杂，是在多种基因遗传因素的共同作用下，由辅助性T 淋巴细胞介导［1］。辅助性T 细胞可分为Th1 和Th2 两个亚群，其介导的免疫功能失衡在银屑病的发病中发挥关键作用［2］。寻常型斑块状银屑病没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是从绿茶中提取出的多酚活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗癌等多种作用［3-4］。最新研究发现，EGCG能够通过调节Th1/Th2细胞功能抑制结肠炎的炎性水平，提示其可能通过影响Th1/Th2 的免疫平衡对炎性疾病起治疗作用［5］。本研究以 Th1 和 Th2 细胞为研究对象，探讨EGCG对银屑病Th1/Th2免疫细胞平衡的影响及机制，为EGCG在银屑病治疗中的可能应用提供理论依据。

材料与方法

一、材料

1.研究对象：寻常型斑块状银屑病患者33例，其中男 18 例，女15 例，年龄22～56 岁。银屑病面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index，PASI）2.4 ～ 12.3，病程3个月至5年。均来自新乡医学院第一附属医院皮肤科，受试者均根据《中国临床皮肤病学》［6］的诊断标准确诊，且1 个月内未经治疗。所有患者均无其他系统性疾病和自身免疫性疾病。本研究获得新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准（2018119），受试者均签署知情同意书。

2.主要试剂：胎牛血清、青霉素、链霉素和RPMI 1640 培养基为美国Gibco 公司产品。EGCG产自江苏凯吉生物公司（CAS：989-51-5，纯度≥98%）。人白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-10 和干扰素 γ（interferonγ，IFNγ）ELISA 试剂盒为美国R&D Systems 公司产品。Trizol 试剂、逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒产自大连TaKaRa公司。Th1 细胞转录因子T-bet 和Th2 细胞转录因子GATA3和β肌动蛋白引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。

二、实验方法

1.标本采集：抽取银屑病患者空腹肘静脉血10 ml放置于肝素钠抗凝管中。密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。细胞加入含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素的RPMI 1640 完全培养基，放置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。

2.MTT检测细胞活力：PBMC以6× 103个/孔接种于96孔板，每组3个复孔。EGCG 溶解于不含血清的RPMI 1640 培养基中，PBMC 培养至对数生长期时分别加入20、40、60、80、100 μmol/L 的EGCG，以不加EGCG 的正常培养细胞为对照，培养24 h。弃原培养液后每孔加入5 g/L MTT 20 μl，37 ℃培养4 h。弃上清液，每孔加入150 μl 二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min 使结晶充分溶解，使用酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）检测细胞吸光度（A490 值），计算细胞活力，选取EGCG 作用浓度。

3.EGCG 处理PBMC：随机选取3 例斑块状银屑病患者的PBMC，加入60 μmol/L 的EGCG，以不加EGCG的正常培养细胞为对照，培养24 h后作后续检测。

4.流式细胞仪检测Th1 和Th2 细胞比例：实验细胞经0.25%胰酶消化，PBS 洗涤、离心，再用100 μl 缓冲液重悬细胞后，加入 FITC-CD4 进行表面染色、固定和破膜，随后加入PE-IFNγ或PE-IL4，4 ℃孵育30 min，PBS 漂洗3 次，然后上流式细胞仪检测Th1和Th2细胞比例。

5.ELISA 法检测细胞因子：PBMC 经过EGCG处理后，根据ELISA试剂盒说明书步骤分别检测细胞培养上清液中Th1 细胞分泌因子（IL-2 和IFNγ）和Th2细胞分泌因子（IL-4和IL-10）表达量。

6.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：Trizol 法提取细胞总RNA。紫外分光光度计检测RNA 浓度，100 ng总RNA用逆转录得到cDNA。以β肌动蛋白为内参基因，用qRT-PCR 试剂盒检测T-bet、GATA3 mRNA表达水平。T-bet正向引物序列为5′-CCCATCCCTTCCCTGTAT-3′，反向引物为 5′-GTC CATTCTCCGTTCTCCA-3′；GATA3的正向引物为 5′-TCACAAAATGAACGGACAGAACC-3′，反向引物为 5′-GGTGGTCTGACAGTTCGCAC-3′；β 肌动蛋白正向引物序列为 5′ -CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，反向引物为5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′。PCR 反应程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40个循环，40 ℃ 15 min。2-ΔΔCt计算mRNA表达量。

7.统计学分析：采用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计学处理，计量资料采用表示，实验数据用t检验分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、MTT法检测EGCG对PBMC的毒性

见图1。EGCG 作用 PBMC 24 h 后，与对照组（不加EGCG）相比，20、40、60 μmol/L EGCG组PBMC活力没有显著变化，80 μmol/L 组和100 μmol/L 组显著下降（t=5.17，P=0.006；t=10.09，P=0.005）。因此选择60 μmol/L为EGCG作用细胞的最适无毒浓度。

二、EGCG对Th1/Th2比例的影响

见图2。60 μmol/L EGCG 处理 PBMC 后，Th1的细胞水平低于对照组，两组差异有统计学意义（t=3.43，P=0.026）；Th2细胞水平高于对照组，两组差异有统计学意义（t=6.68，P=0.026）。

三、EGCG 对银屑病患者Th1、Th2细胞因子表达的影响

结果显示，与对照组相比，EGCG 组IL-2 和IFNγ水平显著降低（P＜ 0.05），IL-4和IL-10表达水平显著提高（P＜ 0.05）。见表1。

四、EGCG对银屑病患者 Th1、Th2转录因子表达的影响

60 μmol/L EGCG 处理细胞后，EGCG 组 T-bet mRNA表达量（1.21±0.19）低于对照组（2.56±0.22），两组差异有统计学意义（t= 11.99，P＜ 0.001）；GATA3 mRNA表达量（3.21 ± 0.24）高于对照组（1.47± 0.11），两组差异有统计学意义（t=18.62，P＜ 0.001）。

讨 论

图1 不同浓度没食子儿茶素没食子酸酯对银屑病患者外周血单个核细胞活力的影响 1 ～ 6：分别为0（对照组）、20、40、60、80、100 μmol/L EGCG组

图2 没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对银屑病患者外周血单个核细胞Th1 和Th2 细胞的影响 2A：流式细胞仪检测Th1 和Th2细胞数；2B：不同组中Th1和Th2细胞占PBMC的比例

表1 没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）刺激下外周血单个核细胞细胞分析细胞因子变化（，ng/L）

表1 没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）刺激下外周血单个核细胞细胞分析细胞因子变化（，ng/L）

注：a 与对照组比较，P＜0.05

分组对照组EGCG t值P值白细胞介素2 1 568.32±196.45 824.45±101.21a 5.83 0.004干扰素γ 3 287.63±235.54 1 623.62±185.56a 9.61＜0.001白细胞介素4 225.38±26.92 389.48±46.63a 5.28 0.006白细胞介素10 165.46±32.25 285.95±53.28a 3.35 0.029

研究证明，EGCG 具有抗炎活性，对动脉粥样硬化、神经系统炎症、食管炎等疾病有治疗作用［7］。Th1/Th2免疫比例失衡在银屑病的发病过程中也起到重要作用［8］。通过调节Th1/Th2比例减缓疾病严重程度已成为研究热点之一［9］。我们的前期研究发现，EGCG 可以抑制IL-17 诱导的角质形成细胞增殖和凋亡异常［10］。为了研究EGCG 对斑块状银屑病免疫的影响，在本研究中，我们利用斑块状银屑病患者PBMC，研究EGCG 对Th1/Th2 细胞的调节作用。

T 细胞的效应功能大部分是通过细胞因子调控的，不同的T细胞亚群通过分泌特异细胞因子发挥不同的生物学功能。Th1 型细胞通过分泌细胞因子IFNγ和IL-2活化毒性T细胞、巨噬细胞，并促进对靶细胞的杀伤和吞噬［11］。研究表明，IFNγ 和IL-2 在银屑病患者的血清和皮损中表达显著升高［12］。银屑病患者Th2细胞通过分泌IL-4和IL-10因子发挥炎症抑制作用，并且IL-4 和IL-10 在轻重度银屑病患者血清中均出现异常低表达［13-14］。我们的前期研究发现，在银屑病患者外周血中IFNγ和 IL-2 高表达，而 IL-4 和 IL-10 低表达［15］。本文结果表明，EGCG 降低银屑病患者PBMC Th1 细胞因子IL-2和IFNγ分泌量，同时增加Th2细胞因子IL-4和IL-10分泌量，从而发挥免疫调节作用。

为了探讨EGCG 对斑块状银屑病可能的治疗作用，我们针对性探讨了EGCG对斑块状银屑病患者 PBMC 的影响。结果显示，EGCG 能下调 Th1 细胞水平，上调Th2细胞水平，表明其对Th1/Th2细胞免疫平衡有调节作用。在T 细胞的亚群分化过程中，转录因子具有重要的调节作用。转录因子T-bet 和 GATA3 分别特异性表达在 Th1 和 Th2 细胞中。研究表明，T-bet 不仅能够促进Th1 细胞因子IFNγ、IL-12 的产生，而且可以抑制Th2 细胞因子IL-4的产生，即其具有促进Th1型细胞分化作用的同时也能抑制Th2 型细胞分化［16］。转录因子GATA3 能够通过提升 IL-4 并抑制 IFNγ 的表达，促进发育中的Th1 型细胞反转为Th2 型，特异性的调控 Th2 细胞的分化［17］。本研究结果显示，EGCG 抑制银屑病患者PBMC 中T-bet mRNA 表达，并促进GATA3 mRNA 表达，说明 EGCG 对 Th1 和 Th2 型细胞的转录因子有调节作用。

综上所述，我们的实验结果证实，EGCG 能够减少银屑病患者Th1细胞数量，抑制Th1细胞因子和转录因子的表达，同时上调Th2 细胞数量及Th2细胞因子和转录因子的表达，提示EGCG可能通过调节Th1/Th2 细胞平衡，影响银屑病的发病进程。在今后的研究中，我们可以继续探索EGCG对银屑病患者免疫异常的影响，例如对Th17，Treg 等免疫细胞影响等。另外还会从体内实验出发，研究在动物模型中EGCG的药物作用，为其在临床上的应用提供更多依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突