自然发酵酸菜汁中乳酸杆菌的分离与鉴定

孟建宇，徐慧欣

(内蒙古农业大学 生命科学学院应用与环境微生物实验室, 呼和浩特 010011)

酸菜是大众化蔬菜腌渍品，在我国历史悠久，是东北、内蒙古等地区的主要副食品之一，深受消费者的喜爱。研究酸菜发酵微生物对于酸菜品质的提升具有一定的现实意义[1]。乳酸菌是指一类能将可发酵性碳水化合物降解，产生大量乳酸的非病原性的革兰氏阳性球菌或杆菌的总称,主要有乳酸球菌属、乳酸链球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属和芽孢杆菌属[2,3]。乳酸菌能使发酵酸菜产酸、产细菌素，提高食品营养价值，改善食品风味，延长保存时间，对人体具有多方面的保健作用[4,5]，如能调节肠道菌群，维持体内微生态平衡，消除体内有毒物质的产生，降低胆固醇，增强免疫力等[6]。对传统发酵蔬菜中乳酸菌多样性的研究，对于开发和利用我国传统发酵食品中蕴含的微生物资源，阐明发酵蔬菜品质的形成机理，进而改进发酵蔬菜的生产工艺有着重要的现实意义[7]。乳酸菌对食品工业有重要的经济价值，并且乳酸菌及其细菌素可作为天然来源的食品添加剂[8，9]，因此，对传统食品中乳酸菌资源进行开发，筛选出生长性能好、产酸力强、抗性强的优良菌株，才能更好地满足食品工业发酵过程。本试验利用经典分类法和16S rDNA序列分析法，对自然发酵酸菜汁中的乳酸菌进行分离、鉴定，为其进一步深入研究和开发利用提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品

农家酸菜汁:采自内蒙古农业大学家属院自制酸菜。

1.1.2 培养基

乳酸菌分离培养基：牛肉膏1%；蛋白胨1%；酵母膏1%；葡萄糖1%；番茄汁10%； 吐温80 0.05%；CaCO32%；溴甲酚绿0.01%；琼脂1.5%； 蒸馏水100 mL；胡萝卜汁10%；pH 6.5。

1.1.3 主要仪器设备

JA2003型电子分析天平 上海越平科学仪器有限公司；SX-500 型全自动高温高压灭菌锅 TDMY KOGYO 公司；HWS12型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；移液器 Bay Gene Biotech公司；HZQ-C型空气浴振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器厂；GSP-9080 MBE型隔水式恒温培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HR40-ⅡA2型生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司；T6新世纪型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Z-16PK离心机 Sigma公司；2720 PCR仪 美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分离和纯化

采用10倍稀释法将样品悬浮液稀释至10-7, 取每个浓度的稀释液100 μL均匀涂布于固体培养基平板，30 ℃恒温培养3～5 d，每个稀释度做3个重复。观察平板中菌落生长情况，挑选特征菌落进行分离纯化，并对其进行形态特征观察和生理生化实验[10]。

1.2.2 菌株的16S rDNA序列分析

DNA的提取参考文献[11]的方法。选用细菌通用引物对27F(5′-TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA-3′)和1492R(5′-AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′)进行PCR扩增。PCR产物采用SYBR Green Ⅰ作为标记，在1%(W/V)琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液中进行电泳测定。以Marker DL2000作为对照，在紫外灯下观察DNA谱带，照相。使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京中科瑞泰有限公司)进行纯化。用质粒连接试剂盒(pMD19-T vector，大连宝生物工程有限公司)进行目的片段的连接。用M13(M13+5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′、M13-5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)引物进行菌落PCR扩增重组质粒检测，将阳性克隆扩培后由中可瑞泰公司测序。获得的核酸序列用GenBank数据库中的序列进行Blast相似性比较，并下载最相似序列。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的形态和生理生化试验

从农家自然发酵的酸菜汁中分离到3株乳酸菌菌株，菌落形态见表1，部分生理生化试验见表2。3株乳酸菌均为G+菌，菌落边缘整齐，表面湿润，不透明，产色素。生理生化试验显示：过氧化氢酶试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验均为阴性，可以利用葡萄糖和半乳糖，在15 ℃、pH 4.5条件下生长。菌落形态和生理生化试验显示符合乳杆菌属特征。

表1 乳酸菌菌落特征Table 1 Colony characteristics of lactic acid bacteria

表2 乳酸菌的生理生化试验Table 2 Physiological and biochemical experiments of lactic acid bacteria

2.2 菌株的16S rDNA鉴定

提取菌株的DNA后用琼脂糖凝胶进行检测，DNA电泳结果(见图1)显示得到的DNA较完整，可用于后续的分析。对菌株的DNA进行16S rDNA PCR扩增，产物条带位于Marker的2000～1000 bp之间，约1400 bp(见图2)，符合预期长度。产物纯化后进行pMD19-T载体连接转化，挑取阳性克隆子进行菌落PCR检测后测序。测序得到3株乳酸菌16S rDNA部分片段，长度均约为800 bp，利用NCBI数据库的Blast程序进行同源性分析，结果见表3。SC2-1、SC2-3、SC4-1与Lactobacillusplantarum的相似度均为100%。

图1 纯菌DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测Fig.1 Agarose gel electrophoresis for the detection of pure bacteria DNA

图2 PCR产物电泳图Fig.2 PCR product electrophoretogram

菌株编号Blast最高同源菌 相似度(%) 最高同源属名SC2-1Lactobacillus plantarum100乳杆菌属SC2-3Lactobacillus plantarum100乳杆菌属SC4-1Lactobacillus plantarum100乳杆菌属

3 结论与讨论

从自然发酵酸菜汁中分离到3株乳酸菌SC2-1、SC2-3和SC4-1，菌落为圆形，湿润，表面光滑或凸起，不透明，深绿色；过氧化氢酶试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验等均为阴性，G+，可以利用葡萄糖和半乳糖，在15 ℃、pH 4.5条件下生长；对其进行16S rDNA序列测定，利用NCBI数据库的Blast程序对测序获得的序列进行同源性分析， 3株菌与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的相似度达100%。形态特征和生理生化试验及16S rDNA序列分析显示，该3株乳酸菌均属于乳杆菌属(Lactobacillus)。

酸菜是经过乳酸菌发酵形成的。乳酸菌及其代谢产物中既不具备分解纤维素的酶系统，也不具备水解蛋白质的酶系。因此，既不会破坏植物细胞组织，又不会分解蛋白质和氨基酸；既能保鲜，又可增强产品风味[12]。酸菜中乳酸菌各项性能的优劣直接关系到泡菜的质量，所以乳酸菌对于提高酸菜的营养价值极为重要。研究自然发酵酸菜微生物变化趋势，分离自然发酵酸白菜中的优良菌株，再利用混合发酵技术模拟自然条件接种发酵，可在提高产品风味和品质的前提下缩短发酵周期[13]。

植物乳杆菌常存在于发酵的蔬菜和果汁中，是传统酱腌菜中的优势菌[14]。植物乳杆菌还是人体肠道常见的乳杆菌之一，对调节宿主健康具有重要的作用，是目前研究的热点[15]。相关报道表明，我国一些少数民族地区的传统发酵食品如酸马奶、开菲尔等的乳酸菌资源开发利用较多。内蒙古地区百姓家有制作酱腌菜的传统，其中蕴藏着丰富的乳酸菌资源还未被开发利用。因此，针对从内蒙古地区百姓家庭自然发酵的酱腌菜中采集、分离获取的植物乳杆菌进行深入研究，对筛选性状优良的植物乳杆菌菌株，以及对植物乳杆菌的进一步开发利用具有重要的意义。