一测多评法同时测定清解颗粒中3 种成分

唐 林， 肖望重， 黄 莉， 雷 昌， 夏新华

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；2.中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙410208；3.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙410208）

清解颗粒为湖南中医药大学第一附属医院的院内制剂，临床用于治疗小儿急性支气管炎和小儿慢性支气管炎的急性发作，疗效显著，该制剂由生石膏、苦杏仁、防风、焦山楂等12 味中药组成，具有解表清热、化痰止咳的功效［1］，苦杏仁、防风为方中君药，其中苦杏仁苷为前者指标性成分，升麻素苷，5-O-甲基维斯阿米醇苷为后者指标性成分，三者均具有明显的止咳、祛痰、平喘、抗炎、抗病毒等药理作用［2-4］。课题组前期对清解颗粒提取工艺进行研究，建立HPLC 法测定指标成分含有量，但该方法操作繁琐，成本较高［5］。

近年来，一测多评法在中药多指标质量评价过程中受到重视，其优势为采用相对校正因子，在仅使用1 个对照品（易得、价廉、稳定）的情况下实现多指标成分同步测定，成为一种适合中药特点的多指标质量评价新模式［6］，已在丹参、黄连、金银花、人参、三七、复方丹参片、栀子金花丸等多种中药及复方制剂的多指标质量控制中得到了应用［7-9］。因此，本实验建立一测多评法，以含有量最高、廉价易得的苦杏仁苷为内标，建立其与升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷之间的相对校正因子，探讨该方法用于清解颗粒成分含有量测定的可行性，同时也可为该制剂质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置DEAB806546 高压四元泵、DEAAC12853 自动进样器、DEACN13975 柱温箱、DEAAX03328DAD 检测器、Agilent 1260 series 色谱工作站（美国Agilent Technologies 公司）；Waters e2695 高效液相仪，配置Waters 2489 UV 检测器、Empower 3 色谱数据工作站（美国Waters 公司）；Hei-Vap Advantage 型旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司）；AL-204 型分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］；SK-7200HP 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药 白芍、柴胡等中药饮片均购自康美药业股份有限公司，经湖南中医药大学药学院刘塔斯教授鉴定为正品，符合2015 年版《中国药典》 项下规定。苦杏仁苷（批号110820-201506，含有量93.4%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-201509， 含 有 量 95.8%）、 升 麻 素 苷 （批 号111522-201511，含有量94.8%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈、冰醋酸为色谱纯（德国默克公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水（法国威立雅有限公司Purelab Option Q15 超 纯 水 机 制 备）。 清 解 颗 粒 样 品 （批 号20180401、20180501、20180801），由湖南省中医药研究院中药研究所制备。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量， 置于25 mL量瓶中，甲醇溶解定容，得到贮备液（三者质量浓度分别为1.236、0.748、0.396 mg／mL），于冰箱中冷藏备用。精密量取适量，加甲醇稀释，即 得 （每 1 mL 分 别 含 三 者 0.247、 0.150、0.079 mg）。

2.1.2 供试品溶液 取颗粒2 g，研细，精密称取适量， 置于250 mL 具塞锥形瓶中， 精密加入50 mL甲醇，称定质量，超声（功率250 W、频率50 kHz） 提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL 量瓶中，稀释至刻度， 摇匀， 续滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按处方比例和制备工艺分别制备缺苦杏仁、防风的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 依利特C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A） -乙腈（B） -0.1%冰醋酸（C），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1 mL／min；检测波长210 nm（0 ～20 min，苦杏仁苷）、254 nm（20 ～40 min，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷）；柱温30 ℃；进样量5 μL。在上述色谱条件下，各成分分离度良好，阴性无干扰，色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取对照品贮备液适量，按一定比例配制成6 个质量浓度，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度试验 精密量取供试品 （批号20180801） 溶液5 μL，在“2.2” 项色谱条件下进样测定6 次，测得苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积RSD 分别为0.72%、0.44%、0.39%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.3 稳定性试验 精密量取供试品 （批号20180801） 溶液5 μL，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积RSD分别为0.77%、2.24%、2.35%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品 （批号20180801），按“2.1.2” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷含有量RSD 分别为2.87%、1.65%、2.10%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取同一批样品（批号20180801）约1 g（含苦杏仁苷7.60 mg、升麻素苷1.22 mg、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.44 mg），共6 份，精密加入苦杏仁苷对照品溶液（3.259 4 g／mL）2 mL、升麻素苷对照品溶液（0.322 mg／mL）4 mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液（0.35 mg／mL）1.60 mL，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.4 相对校正因子测定 采用多点校正法。取“2.1.1” 项下对照品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，以苦杏仁苷为内标，计算其他2 种成分相对 校正因子fk／m， 公式 为（Ak为内标峰面积，Wk为内标质量浓度，Am为组分m 峰面积，Wm为组分m 质量浓度）［10］，结果见表4。

表4 各成分相对校正因子Tab.4 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性考察

2.5.1 不同仪器、色谱柱 取“2.1.1” 项下对照品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，考察不同仪器（Waters e2489、Agilent 1260）、色谱柱（依利特C18、Agilent SB-C18、Agilent HC-C18）对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响，耐用性良好（RSD＜3.0%）。

表5 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 柱温 取“2.1.1” 项下对照品溶液，在“2.2” 项色谱条件下测定柱温25、30、35、40 ℃时的相对校正因子，结果见表6，可知均无明显影响，重复性良好（RSD＜3.0%）。

2.5.3 色谱峰定位 以苦杏仁苷为内标，考察其他2 种成分相对保留时间（待测成分与内标成分保留时间之比，tR） 和保留时间差（待测成分与内标成分保留时间之差，Δt），结果见表7，可知以tR为 定 位 标 准 时， 各 成 分 差 异 较 大 （RSD ＞3.0%）；以Δt 为定位标准时，各成分差异较小（RSD＜3.0%），即可将其用于色谱峰定位。

表6 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.6 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表7 各成分相对保留值、保留时间差Tab.7 Relative retention values and retention time differences for various constituents

2.6 样品含有量测定 分别采用外标法和一测多评法测定3 批样品含有量，结果见表8，可知2 种方法所得结果无明显差异。

表8 各成分含有量测定结果（mg／g）Tab.8 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 讨论

本实验检测波长根据《中国药典》 确定，即苦杏仁苷为210 nm，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷为254 nm，故采用二极管阵列检测器的波长切换功能，具有较高的灵敏度、准确度、专属性。在选择流动相时，比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-盐 （0.1%冰醋酸、0.1%磷酸、0.1%甲酸） 的洗脱效果，发现甲醇-水洗脱苦杏仁苷分离效果较好，乙腈-水洗脱5-O-甲基维斯阿米醇苷分离效果较好，而甲醇-乙腈-水洗脱各成分时基本达到基线分离，但升麻素苷存在轻微拖尾，故考虑在水相中加入弱酸来改善峰形拖尾，由于甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸洗脱时成分分离度较好，峰形对称，故以其为流动相。

前期分别以苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷为内标，比较其相对校正因子，发现苦杏仁苷最稳定（RSD＜2%），而且较易分离获得，对照品价格便宜， 含有量最高， 故选择其作为内标。

对于一测多评法的色谱峰定位，主要是采用相对保留时间［11-12］。但本实验所测成分的相对保留时间在不同色谱柱中明显不同，可能是因为它们与内标色谱峰保留时间的差异较大［13-14］，故选择保留时间差进行定位。