柚皮素纳米混悬剂的制备及其体内药动学行为

裴岩岩， 闫春生， 牛美兰， 郭志刚

（黄河科技学院，河南 郑州450005）

柚皮素是一种二氢黄酮类化合物，广泛存在于芸香科植物中，具有抗病毒、抗氧化、抗炎、镇咳、抗肿瘤、抗纤维化、预防动脉粥样硬化等多种药理活性［1-3］，显示出巨大的潜在利用价值，但其溶解度不理想［4］，导致体内吸收较差，口服后药效大打折扣［5］。

目前，纳米制剂技术包括固体脂质纳米粒［6］、脂质体［7］、 纳米结构脂质载体［8］、自微乳等［9］，但都存在一定问题，如制备工艺复杂、载药量较低等。纳米混悬剂是指难溶性药物通过湿磨、均质匀化等制剂技术制备而成的一种“纯” 药物胶态分散体系［10-13］，其制备工艺和处方简单，载药量大，适合工业化生产，有助于增加药物溶解度、促进药物吸收、提高生物利用度等，从而扩大临床应用范围。因此，本实验制备柚皮素纳米混悬剂，并考察其体内药动学行为，为相关制剂研发提供参考。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（配置DAD 检测器，美国Agilent 公司）； AR2140 型电子天平［梅特勒-托利多仪器 （上海） 有限公司］； DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；VORTEX-5 型涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；ATS 型均质机（加拿大Seeker 公司）；RE5299 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；MD200-2 型氮气吹扫仪（杭州奥威仪器有限公司）；Master-sizer 型粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司）。

柚皮素原料药 （批号20170223， 含有量98.7%，西安瑞迪生物科技有限公司）；柚皮素对照品（批号Y-034-181217，成都瑞芬思生物科技有限公司）；卵磷脂（批号PC-98T，辅必成上海医药科技有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮K30 （PVP K30，批号25000240379，亚什兰集团公司）；肝素钠（批号20160511S，新泰市朝阳生化研究所）。

清洁级SD 大鼠，雌雄兼用，体质量（300±20） g， 河南省动物实验中心， 动物许可证号SCXK（豫）2016-0001。

2 方法与结果

2.1 柚皮素含有量测定

2.1.1 色谱条件 Diamonsil BDS-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇-水（65 ∶35）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长287 nm；进样量20 μL。

2.1.2 线性关系考察 精密称取柚皮素对照品20.00 mg，加入50 mL 甲醇溶解，得400.0 μg／mL贮备液，甲醇稀释成200.0、100.0、50.0、10.0、1.0 μg／mL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以峰面积（Y） 对溶液质量浓度（X） 进行回归，得方程为Y ＝40.056 3X＋4.125 7（R2＝0.999 4），在1.0～200.0 μg／mL 范围线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取纳米混悬液0.5 mL，加入10 mL 甲醇超声5 min，即得。

2.1.4 方法学考察 取供试品溶液，于0、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得柚皮素峰面积RSD 为0.64%，表明溶液在48 h内稳定性良好。取1.0、100.0、200.0 μg／mL 对照品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，连续6 d，测得日内精密度RSD 均小于0.52%，日间精密度RSD 均小于1.33%，表明该方法精密度良好。平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得柚皮素峰面积RSD 为1.39%，表明该方法重复性良好。空白纳米混悬液分别配制成40、60、80 μg／mL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得柚皮素平均加样回收率为99.36%，RSD小于1.80%。取对照品溶液逐步稀释，测得检测限为0.5 ng／mL，定量限为1.2 ng／mL。

2.2 单因素试验

2.2.1 表面活性剂种类 在制备温度25 ℃、均质压力60 MPa、均质次数10 次的条件下，考察PVP K30、卵磷脂、两者混合物（1 ∶1） 对纳米粒粒径的影响。结果，平均粒径分别为（281.42±5.93）、（224.79±6.07）、 （182.50±4.11） nm， 故选择PVP K30-卵磷脂混合物（1 ∶1） 作为表面活性剂。

2.2.2 制备温度 在表面活性剂PVP K30-卵磷脂（1 ∶1）、均质压力60 MPa、均质次数10 次的条件下，考察制备温度0、25、50 ℃对纳米粒粒径的影响，结果见图1。由图可知，在0 ℃时粒径最小，故选择其作为制备温度。

图1 制备温度对粒径的影响Fig.1 Effect of preparation temperature on particle size

2.2.3 均质压力 在表面活性剂PVP K30-卵磷脂（1 ∶1）、制备温度0 ℃、均质次数为10 次的条件下，考察均质压力40、60、80、100 MPa 对纳米粒粒径的影响，结果见图2。由图可知，在均质压力40 ～80 MPa 范围内粒径逐渐变小， 但增大至100 MPa时反而上升，故选择80 MPa 作为均质压力。

图2 均质压力对粒径的影响Fig.2 Effect of homogenization pressure on particle size

2.2.4 均质次数 在表面活性剂PVP K30-卵磷脂（1 ∶1）、制备温度0 ℃、均质压力80 MPa 的条件下，考察均质次数6、8、10、12、15、20 次对纳米粒粒径的影响，结果见图3。由图可知，随着均质次数增加粒径逐渐减小，在12 次时最小，而15、20 次时略有变大趋势，故选择12 次作为均质次数。

图3 均质次数对粒径的影响Fig.3 Effect of homogenization frequency on particle size

2.3 纳米混悬剂制备 根据“2.2” 项下结果，确定最优制备工艺为取50 mg 柚皮素溶于5 mL 无水乙醇中，作为溶液A；称取泊洛沙姆、卵磷脂各0.1 g，加入50 mL 蒸馏水溶解，作为溶液B，在制备温度0 ℃、转速800 r／min 的条件下，将溶液A 缓慢滴加到溶液B 中，旋蒸约30 min 以除去乙醇，浓缩后体积约为40 mL，在80 MPa 均质压力下均质12 次，即得。

2.4 粒径、PDI、Zeta 电位测定 取纳米混悬剂100 μL，3.5 mL 蒸馏水稀释，测定粒径、PDI、Zeta 电位，平行6 次，取平均值，测得三者分别为（161.67±4.23） nm、0.105±0.011、 （-30.47±1.15） mV。见图4～5。

图4 纳米混悬剂粒径分布Fig.4 Particle size distribution of nanosuspensions

图5 纳米混悬剂Zeta 电位Fig.5 Zeta potential of nanosuspensions

2.5 冻干粉制备 取纳米混悬液若干份，每份4 mL，以5%甘露醇-乳糖（3 ∶2） 为冻干保护剂，按照表1 程序进行预冻、升华、解析，即得纳米混悬液冻干粉。取0.2 g，0.5 mL 蒸馏水复溶，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项下方法进样测定，测得含有量为2.22%，再按照纳米混悬剂处方比例称取柚皮素、辅料，加入蒸馏水、6%甘露醇-乳糖（3 ∶2），同法冻干，即得物理混合物冻干粉。

表1 冻干粉冻干程序Tab.1 Freeze-drying procedure for freeze-dried powder

2.6 体外释药行为 取纳米混悬剂、物理混合物冻干粉各 0.2 g （以柚皮素计， 含有量为4.44 mg），装入胶囊，按2015 年版《中国药典》四部0931 项下二法进行考察，温度（37±1）℃，转速100 r／min，溶出介质100 mL 超声水，于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min 各取样3.0 mL，并补足至3.0 mL，溶液经0.22 μm 微孔滤膜过滤，HPLC 法测定柚皮素含有量，计算累积释放度，绘制溶出曲线，见图6。由图可知，纳米混悬剂冻干粉在40 min 时基本完全溶出，而物理混合物冻干粉在90 min 时仅为35.60%。

图6 样品体外释放曲线Fig.6 In vitro release curves for samples

2.7 药动学行为研究

2.7.1 灌胃液制备 取纳米混悬剂、物理混合物冻干粉（以柚皮素计5 mg） 各228 mg，置于3 mL蒸馏水中，混匀，即得。

2.7.2 给药方案及血浆采集 12 只大鼠随机分为2 组，每组6 只，给药剂量15 mg／kg，于0、5、10、15、30、45、60、90、180、240、360 min 眼眶采血各约0.3 mL， 置于肝素化离心管中，3 500 r／min离心5 min，分取上层血浆置于另一空白离心管中，-20 ℃冰箱中保存。

2.7.3 样品处理［6］取血浆样品100 μL，加入2%甲酸30 μL，涡旋3 min，继续加入乙酸乙酯1.5 mL， 涡 旋8 min 提 取 后12 000 r／min 离 心15 min，上清液转移至另一空白离心管中，45 ℃氮气吹干，100 μL 甲醇复溶，置于进样瓶内衬管中，在“2.1.1” 项条件下进样20 μL 测定。

2.7.4 方法学考察 配制500、400、250、100、50、20 ng／mL 对照品溶液，各取300 μL，氮气吹干后加入300 μL 空白血浆，振荡混匀，即得对照品溶液，在“2.1.1” 项条件下进样20 μL 测定，以峰面积（Y） 对溶液质量浓度（X） 进行线性回归，得方程为Y＝0.112 7X＋9.687 2（R2＝0.998 6）。取20、250、500 ng／mL 对照品溶液，在“2.1.1”项条件下进样测定6 次，测得柚皮素日内精密度RSD 均小于1.92%，表明该方法精密度良好。取处理后的血浆样品溶液，48 h 内设置6 次进样点，在“2.1.1” 项条件下进样测定，测得柚皮素峰面积RSD 为1.88%，表明溶液在48 h 内稳定性良好。取500、250、50 ng／mL 血浆对照品溶液，在“2.1.1” 项条件下进样测定， 测得回收率在91.38%～96.52%之间。

2.7.5 测定结果 绘制血药浓度-时间曲线，通过3P97 程序统计矩模型计算主要药动学参数，结果见图7、表2。由此可知，纳米混悬剂tmax较柚皮素显著提前 （P ＜0.05），Cmax由 （203.81±30.41）ng／mL 提高至 （378.24±81.53） ng／mL， AUC0～t为后者的1.86 倍。

图7 样品血药浓度-时间曲线Fig.7 Plasma concentration-time curves for samples

表2 样品主要药动学参数Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples

表2 样品主要药动学参数Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples

注：与柚皮素比较，*P＜0.05，**P＜0.01

参数 单位 柚皮素 纳米混悬剂tCmmaxa x ng·m h L-1 20 13..98 61± ±03.0 3.74 1 37 18..02 84± ±08.1 1.9 53***AUC0～t ng·mL-1·h 706.57±81.54 1 318.19±143.79**AUC0～∞ ng·mL-1·h 719.34±84.17 1 406.44±150.91**

3 讨论

在制备纳米混悬剂过程中，有机溶剂与水互溶程度越高，搅拌条件下两相混合时扩散越快，越有利于小粒径纳米粒快速形成，综合考虑溶解度、毒性等因素，选择无水乙醇作为制备溶剂。 据报道［14］，沉淀法制备纳米粒是放热过程，温度较高时会增加纳米粒子之间碰撞机会，容易出现晶体成长和纳米粒聚集，故较低的制备温度有助于获得粒径、PDI 均较小的纳米混悬剂，本实验选择0 ℃（冰水混合物）。

另外，制备时需加入一定量表面活性剂，通过吸附于药物粒子表面来提供电荷排斥作用或立体位阻作用，从而防止纳米粒聚集，提高稳定性。前期预实验对泊洛沙姆188、聚山梨酯80、聚乙烯醇等进行了筛选，发现所得纳米粒粒径均较大，其原因可能是这些表面活性剂不能吸附于纳米粒表面，无法提供电荷排斥作用或立体位阻作用［15］。由于表面活性剂联合应用可提高纳米粒长期稳定性［16］，故实验选择PVP K30-卵磷脂（1 ∶1），此时所制备的纳米粒粒径较小。

体内药动学研究结果显示，柚皮素纳米混悬剂相对生物利用度较原料药提高了1.68 倍，其原因可能如下：纳米粒口服后一部分可在伊派尔结（约占整个胃肠道黏膜的1／4） 中聚集，并通过淋巴结中的M 细胞最终进入血液循环［17-18］；增加了药物与胃肠道的接触面积，同时其黏附性使药物在胃肠道停留时间延长，有助于充分吸收；纳米混悬剂技术提高了柚皮素溶解度和溶出度，有助于溶解后的药物顺利吸收进入血液循环；处方中表面活性剂也具有促进药物吸收的作用。据报道［19］，纳米混悬剂生物利用度提高程度还受难溶性药物基本性质（分子量大小、脂溶性、熔点、晶型、分子极性表面积等）、纳米混悬剂本身理化性质（稳定性、溶解度、粒径分布等）、机体生理特性等因素影响，故将不同难溶性药物制成纳米混悬剂后，其生物利用度提高程度存在较大差别，值得研究人员关注。