加味苓桂术甘汤中挥发性成分β-环糊精包合工艺的优化

顾思浩， 李 宁， 李 玲， 王 冰， 张 彤

（1.上海中医药大学中药学院，上海201203；2.上海中医药大学教学实验中心，上海201203）

苓桂术甘汤处方源自《金匮要略》，是温阳利水代表方之一，能显著减轻非酒精性脂肪肝的症状［1］。上海中医药大学季光教授在该方基础上加入五味子，得到加味苓桂术甘汤，而且五味子有收涩、益气等功效，可抑制脂肪过氧化，进而保护肝脏［2］，共奏全方健脾利水、温阳化饮之功效，方中温阳药桂枝的有效成分有桂皮醛、肉桂酸、香豆素、原儿茶酸等［3］，其中桂皮醛有明显抗氧化、抗炎［4］、抗病毒活性［5］，以及镇痛、镇静作用，同时具有不稳定、易挥发的特性［6-7］，按古方提取工艺煎煮药材后所得药液中其转移率约为10%，但现代制剂中均有浓缩与干燥工艺测得浓缩液与浸膏粉中不含该成分。因此，为了提高桂皮醛的稳定性，尽可能还原古方提取效果，保证加味苓桂术甘汤疗效，本实验对该方包合工艺进行研究。

采用挥发油收集装置收集挥发油时，易产生不溶于水和油的白色絮状物，油水分离困难，只能收集到芳香水而得不到挥发油。因此，本实验收集芳香水来代替挥发油，并优化β-环糊精包合工艺，以期为加味苓桂术甘汤相关新药上市奠定理论依据，同时为含有挥发性成分中药的包合方法提供新思路。

1 材料

Agilent 1200 series 高效液相色谱仪［安捷伦科技（中国） 有限公司］；Welchrom C18色谱柱［月旭科技（上海） 股份有限公司］；DF 型集热式磁力搅拌器（上海予申仪器有限公司）；JA31002 型电子精密天平（上海精天电子仪器有限公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；KH-400KDB 型台式高功率数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；BS124S型电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；XS105 型电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］。

五味子（批号160426）、桂枝（批号151231、160505）、 茯 苓 （批 号160220）、 白 术 （批 号160104）、甘草（批号160114） 购自上海康桥中药饮片有限公司，经上海中医药大学高级实验师李俊松鉴定为正品。桂皮醛（批号110710-201418） 购自中国食品药品检定研究院； β-环糊精 （批号20160108） 购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，购自安徽时联特种溶剂股份有限公司；其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 芳香水提取 称取12 倍处方量饮片，8 倍量水浸泡30 min 后水煎提取5 h，即得，芳香水收集装置收集。

2.2 包合物制备 称取β-环糊精，加入相应量芳香水中，在规定时间内恒温搅拌后溶液冷却至室温，4 ℃下冷藏24 h 后取出，滤过，弃去滤液，滤渣置于在40 ℃烘箱中干燥4 h，得到白色固体，对其进行研磨，即得，计算包合物得率（芳香水中挥发油量以桂枝中挥发油含有量计），公式为得率＝ ［W包合物／（Wβ-环糊精＋W芳香水中挥发油）］×100%。

2.3 包合率测定 精密量取“2.1” 项下芳香水提液0.5 mL，50%甲醇定容至5 mL，微孔滤膜过滤，HPLC 法测定桂皮醛含有量；精密称取“2.2”项下包合物0.1 g，置于50 mL 锥形瓶中，精密量取25 mL 70%甲醇，加入锥形瓶中，超声（功率250 W、频率40 kHz）30 min，过微孔滤膜，HPLC法测定桂皮醛含有量，计算包合率，公式为包合率＝ （W包合物中桂皮醛／W芳香水中桂皮醛） ×100%。

2.4 桂皮醛含有量测定

2.4.1 色 谱 条 件［8］Welchrom C18色 谱 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相0.05%磷酸-乙腈（38 ∶ 62）； 检 测 波 长290 nm； 体 积 流 量1.0 mL／min；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2.4.2 对照品溶液制备 精密称取桂皮醛对照品452.31 mg，乙腈定容于10 mL 量瓶中，即得。

2.4.3 供试品溶液制备 取“2.2” 项下包合物0.1 g，70%甲醇超声30 min 后定容至25 mL，即得。

2.4.4 阴性样品溶液制备 按处方称取不含桂枝的药材，按“2.1” 项下方法提取， “2.2” 项下方法包合，“2.4.3” 项下方法制备，即得。

2.4.5 线性关系考察 精密移取对照品溶液，70%甲 醇 稀 释 至4.496、 83.99、 22.48、 89.92、224.8 μg／mL，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标 （Y） 进行回归， 得方程为Y ＝104.86X ＋36.60（r ＝0.999 9），在4.496 ～224.8 μg 范围内呈现良好的线性关系。

2.4.6 专属性考察 吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1，可知阴性无干扰，方法专属性良好。

图1 桂皮醛HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of cinnamaldehyde

2.5 正交试验

2.5.1 包合温度筛选 称取β-环糊精适量，80 ℃水浴溶解，制成饱和溶液，降温至指定温度（30、50、70 ℃）。精密量取芳香水100 mL，缓慢加到β-环糊精饱和溶液中，在相应温度下恒温800 r／min 搅拌1 h，冷却至室温，4 ℃下冷藏24 h 后取出，滤过，弃去滤液，滤渣置于40 ℃烘箱中干燥4 h，得到白色固体，对其进行研磨，即得包合物，分别按“2.2” “2.3” 项下方法计算桂皮醛包合率、包合物得率，结果见表1。由表可知，温度越高，包合率越低，推测可能是高温下分子运动过于剧烈，导致部分脱包合现象的发生，降低包合效果；温度越低，包合物得率也有所下降，推测可能是低温下底物反应与溶解不充分所致［9-10］， 由于包合温度50 ℃时包合效果最佳，故选择40、50、60 ℃进行考察。

表1 包合温度筛选结果Tab.1 Results of inclusion temperature screening

表1 包合温度筛选结果Tab.1 Results of inclusion temperature screening

温度／℃ 桂皮醛包合率／% 桂皮醛包合物得率／%30 63.15±0.83 16.01±0.09 50 54.97±0.53 75.20±0.85 70 49.84±0.59 92.59±0.81

2.5.2 芳香水与β-环糊精比例筛选 按比例（芳香水∶β-环糊精＝5 ∶1、10 ∶1、20 ∶1） 称取一定量β-环糊精，80 ℃水浴加热溶解，制成饱和溶液，缓慢降温至50 ℃。精密量取芳香水50 mL，缓慢加入β-环糊精饱和溶液中，恒温800 r／min 搅拌1 h，结束后放至室温，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h，取出，滤过，弃去滤液，滤渣置于40 ℃烘箱中干燥4 h，得到白色固体，对其进行研磨，即得包合物，分别按“2.2” “2.3” 项下方法计算桂皮醛包合率、包合物得率，结果见表2。由表可知，两者比例为5 ∶1、10 ∶1 时包合效果差异不大，而20 ∶1时不理想，故选择5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1 进行考察。

表2 芳香水与β-环糊精比例筛选结果Tab.2 Results of aromatic water-（β-cyclodextrin）ratio screening

表2 芳香水与β-环糊精比例筛选结果Tab.2 Results of aromatic water-（β-cyclodextrin）ratio screening

芳香水∶β-环糊精 桂皮醛包合率／% 桂皮醛包合物得率／%5 ∶1 55.60±0.18 88.25±0.96 10 ∶1 55.88±0.16 77.85±0.73 20 ∶1 49.24±0.45 58.21±0.69

2.5.3 包合方法筛选［11］

方法1：称取β-环糊精5 g，80 ℃水浴加热溶解，制成饱和溶液，缓慢降温至50 ℃。精密量取芳香水50 mL， 缓慢加入饱和溶液中， 恒温800 r／min搅拌1 h 后冷却至室温，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h， 取出， 滤过， 弃去滤液， 滤渣置于40 ℃烘箱中干燥4 h，得到白色固体，对其进行研磨，即得包合物。

方法2：称取β-环糊精5 g，加入50 mL 芳香水中，50 ℃水浴恒温800 r／min 搅拌1 h，冷却至室温，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h，取出，滤过，弃去滤液，滤渣置于40 ℃烘箱中干燥4 h，得到白色固体，对其进行研磨，即得包合物。

分别按“2.2” “2.3” 项下方法计算桂皮醛包合率、包合物得率，结果见表3。由表可知，方法2 所得包合率、包合物得率显著高于方法1（P ＜0.05，P＜0.01），故选择该方法进行包合。

表3 包合方法筛选结果，n＝4）Tab.3 Results of inclusion method screeningn＝4）

表3 包合方法筛选结果，n＝4）Tab.3 Results of inclusion method screeningn＝4）

注：与方法1 比较，*P＜0.05，**P＜0.01

方法 桂皮醛包合率／% 桂皮醛包合物得率／%1 55.88±0.02 77.85±1.98 2 75.12±0.54** 85.89±0.38*

2.5.4 工艺优化 在单因素试验基础上，以芳香水与β-环糊精比例（A）、包合温度（B）、包合时间（C） 为影响因素，包合率、包合物得率为评价指标，选用四因素三水平正交表设计试验。因素水平见表4，结果见表5，方差分析结果见表6。由表5 可知，各因素影响程度依次为A＞B＞C。由表6 可知，各因素均无显著影响（P＞0.05），从减少药物服用量角度出发，选择A2；根据表5 结果，选择B1；考虑到节约能源，选择C1。最终确定，最优工艺为A2B1C1，即芳香水与β-环糊精比例10 ∶1，包合温度40 ℃，包合时间1 h。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels

表5 试验设计及结果Tab.5 Design and results of tests

表6 方差分析Tab.6 Analysis of variance

2.5.5 验证试验 按“2.5.4” 项下优化工艺进行包合，平行3 批，测得桂皮醛包合率为72.06%（RSD ＝2.13%），包合物得率为83.73% （RSD ＝0.84%），可知工艺稳定，重复性好，具有可行性。

2.6 TLC 检测［12-15］为了验证芳香水中挥发性成分是否包合于β-环糊精内部，采用TLC 法进行检测。芳香水中加入石油醚搅拌，静置取上清液，得到供试品a；称取一定量包合物，加入石油醚振摇，静置后取上清液，得到供试品b；称取一定量包合物，70%甲醇超声进行脱包合，得到供试品c；称取一定量β-环糊精加入石油醚振摇，静置后取上清液，得到阴性供试品d；取一定量芳香水、β-环糊精，搅拌混合均匀后加石油醚振摇，静置后取上清液，得到供试品e，按照2015 版《中国药典》 薄层色谱法，毛细管吸取上述5 种供试品溶液各2 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯∶石油醚（60 ～90 ℃） （3 ∶17） 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，结果见图2。由图可知，a、c、e 在相同位置显示黄色斑点，为桂枝挥发性成分；b、d 在相同位置无斑点，表明包合物表面无挥发性成分残留，包合过程中包合物性质未发生变化，而且成分均进入β-环糊精分子。

3 讨论

研究表明，桂枝可促进脂肪代谢［1，16］，主要有效物质为挥发油，含有量约为1%，组成复杂，以桂皮醛为主［17-18］。预实验研究表明，125 g 桂枝提取得到挥发油0.2 mL，查阅文献发现，桂枝经过水蒸气蒸馏法提取后挥发油得率约为0.25%，而且操作复杂［19］；采用挥发油提取器提取时，挥发油密度与水接近，水油分离效果不佳［20］，同时在提取过程中易产生不溶于水和油的白色絮状物［21］；本实验采用芳香水提取器收集芳香水，未发现明显分层，故以其代替挥发油。

图2 样品TLC 色谱图Fig.2 TLC chromtogram of samples

芳香水在包合搅拌过程中，应盖上保鲜膜密封以减少挥发油损失，加入环糊精饱和溶液时可再滴加少量有机溶剂，可使挥发油分散更加完全，有利于包合［22］。本实验比较了芳香水缓慢滴入环糊精饱和溶液搅拌、环糊精加入芳香水搅拌2 种制备方法，发现后者所得包合物中桂皮醛包合率、包合物得率更高。通过TLC 法可确定，挥发性成分经β-环糊精包合后进入包合物内部，可有效地减少其与外界的接触，从而提高制剂稳定性。

包合物得率不能全面代表挥发性成分包合情况，仅对制剂剂量和稳定性有一定影响［23］，该指标过高将导致后续服用量大，会对相关制剂上市和患者顺应性产生影响。本实验发现，芳香水与β-环糊精比例、包合温度、包合时间均无明显影响，从减少药物服用量角度考虑，未选择评分最高的水平，而是采用第二水平（芳香水∶环糊精＝10 ∶1），此时桂皮醛包合率较高，包合物得率较低，能有效减少服用量；以节约能源为出发点，选择最短的包合时间，更符合相关制剂研发和上市的实际需求。

同时，所优化的加味苓桂术甘汤中挥发性成分β-环糊精包合工艺有以下优点： （1） 对于油水分离困难、无法收集到挥发油的中药组分，可直接提取芳香水，而无需通过繁复的纯化操作继续提纯挥发油，操作更便捷； （2） 包合工艺易于操作，重复性高，芳香水无需浓缩，β-环糊精直接加入，耗时更短，包合温度更低，环糊精用量更少； （3）所得包合物中挥发性成分包合率、包合物得率更高； （4） 保留了处方中水溶性、挥发性成分，更接近经典方剂临床服用的真实状态。