抗病毒颗粒HPLC 指纹图谱建立及9 种成分同时测定

陈 婷， 成旭东， 王玳珠， 蒋 斌， 沈夕坤

（南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州215009）

抗病毒颗粒是苏州市中医医院医疗机构制剂，批准文号苏药制字Z04001821，来源于江苏省名中医何焕荣主任中医师经验方，由金银花、连翘、蒲公英、野菊花、板蓝根5 味药材组成，具有清热解毒的功效，适用于急性上呼吸道感染及病毒感染疾病，疗效显著，但原标准仅有性状鉴别及检查项，无法全面评价其质量。中药复方制剂成分复杂，在质量控制中仅采用单一或某几种成分难以反映其整体特征［1-2］，故本实验建立抗病毒颗粒HPLC 指纹图谱，并同时测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷的含有量，从整体上控制该制剂质量。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；AG285 型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-100VDE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；KDC-140HR 型超速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；Milli-Q Synthesis 108 型超纯水仪 （美国密理博公司）。

1.2 试药 绿原酸（批号110753-201415）、咖啡酸 （批 号 110885-201703）、 木 犀 草 苷 （批 号111720-201609）、蒙花苷（批号111528-201710）、连翘酯苷A（批号111810-201606） 对照品均购自中国食品药品检定研究院； 新绿原酸 （批号4974）、隐绿原酸（批号3208）、异绿原酸B（批号3089）、3，5-二咖啡酰奎宁酸（批号6137）、4，5-二咖啡酰奎宁酸（批号3001） 对照品均购自上海诗丹德生物技术有限公司。抗病毒颗粒（批号150307、 150315、 150602、 150608、 151012、151018、 160120、 160128、 160203、 160901、160909、170105） 由苏州市中医医院提供。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -水（含0.1%甲酸） （B），梯度洗脱，程序见表1；体积流 量1.0 mL／min； 检 测 波 长320 nm； 柱 温30 ℃；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 对照品溶液制备 精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷A、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容，摇匀，即得，冷藏备用。

2.3 供试品溶液制备 将颗粒（批号170105） 研细，精密称取0.5 g，置于锥形瓶中，加20 mL 蒸馏水称定质量，超声（50 Hz） 提取30 min，放冷，加水补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.4 HPLC 指纹图谱建立

2.4.1 方法学考察

2.4.1.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，记录色谱图，导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 （2012 年版），测得相似度在0.997～1.000 之间，表明仪器精密度良好。

2.4.1.2 重复性试验 取同一批颗粒，按“2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，各精密吸取10 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，记录色谱图，导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 （2012 年版），测得相似度在0.998 ～1.000 之间，表明该方法重复性良好。

2.4.1.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下于0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录色谱图， 导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 （2012 年版），测得相似度均为1.000，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.2 共有峰标定及归属 将相关数据导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 年版）， 建立指纹图谱 （图1）， 以样品（170501） 为参照，经过多点校正和数据匹配后，平均值法生成对照指纹图谱R，发现各主要色谱峰的出峰时间基本一致。同时，发现17 个共有峰，通过对照品比对和文献查阅确定其中10 个，分别为新绿原酸（2 号峰）、绿原酸（4 号峰）、隐绿原酸（5 号峰）、咖啡酸（6 号峰）、连翘酯苷A（9号峰）、木犀草苷（10 号峰）、异绿原酸B（11 号峰）、3，5-二咖啡酰奎宁酸（12 号峰）、4，5-二咖啡酰奎宁酸（13 号峰）、蒙花苷（16 号峰）。

通过与单味药HPLC 图谱比较，可确定2、4 ～5、10～13 号峰来源于金银花，6 ～7、9 号峰来源于连翘，2、4 ～6、10 ～13、15 ～17 号峰来源于野菊花，3、6～7 号峰来源于蒲公英，见图2。

2.4.3 相似度评价 将12 批样品色谱图输出为*.cdf 格式，导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 （2012 年版），通过多点校正法对色谱峰进行自动匹配，生成共有模式，并在分析检验模式下以样品（批号20170105） 图谱为参照，时间窗0.10，平均数法计算相似度。结果，与生成的对照图谱比较，12 批样品相似度分别 为 0.995、 0.995、 0.993、 0.995、 0.992、0.992、 0.994、 0.994、 0.994、 0.980、 0.979、0.995，表明各批次之间存在较高的均一性。

图1 12 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of twelve batches of samples

图2 各样品HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of various samples

2.4.4 主成分分析 将共有峰峰面积与药材取样量之比，即单位质量药材峰面积通过SPSS 17.0 软件进行主成分分析，以特征值大于1 为提取标准，得到4 个主成分，累积贡献率达到91.131%。其中，第 一 主 成 分 λ ＝6.845， 方 差 贡 献 率 为40.265%，贡献率最大，包含信息最多；第二主成分λ ＝5.675，方差贡献率为33.385%；第三主成分λ ＝1.879，方差贡献率为11.053%；第四主成分λ＝1.093，方差贡献率为6.428%，因子载荷矩阵见表2。由表可知，峰4、12、15 在第一主成分中有明显的正相负荷，表明它们在增加，第一主成分增大；峰2 在第一主成分中有明显的逆负荷；峰7、9 在第二主成分有明显的逆负荷，峰11 有正负荷；峰8 在第三主成分对主成分起到负相关的作用；峰1 是第四主成分中主要决定因子。

表2 因子载荷矩阵Tab.2 Loading matrices for factors

将因子复合除以主成分相对应的特征值的平方根，可得到主成分系数表达式，并计算各样本主成分值。以主成分1、2 分别作为横、纵坐标，将12批样品标入坐标系中，得到空间分布图，见图3。由图可知，各批样品虽有一定距离，但并不大，未实现“分类”，表明它们之间存在一定差异性，但不明显。

图3 主成分得分图Fig.3 Score plot for principal components

2.5 9 种成分含有量测定

2.5.1 色谱条件 在“2.1” 项色谱条件下进行检测，以各成分色谱峰计，理论塔板数大于5 000，分离度大于1.5。

2.5.2 对照品溶液制备 精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容，摇匀，即得（质量浓度分别为333.8、440.8、 265.6、 181.4、 144.4、 222.0、 103.2、160.6、161.6 μg／mL）。

2.5.3 供试品溶液制备 同“2.3” 项。

2.5.4 线性关系考察 取“2.5.2” 项下对照品溶液适量，稀释呈不同质量浓度，在“2.1” 项色谱条件下进样10 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表3，可知各成分在范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.5.5 精密度试验 取“2.5.2” 项下同一对照品溶液，在“2.5.1” 项色谱条件下进样测定6次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷峰面积RSD 分别为0.58%、0.57%、0.68%、0.79%、1.45%、1.17%、1.21%、0.92%、0.16%，表明仪器精密度良好。

2.5.6 重复性试验 取同一批（批号170105） 颗粒，按“2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.5.1” 项色谱条件下进样测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、 蒙花苷峰面积RSD 分别为0.62%、0.70%、1.66%、1.00%、1.03%、1.18%、1.16%、0.79%及0.81%，表明该方法重复性良好。

2.5.7 稳定性试验 取同一批（批号170105） 颗粒，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.5.1” 项色谱条件下进样测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷峰面积RSD 分别为0.73%%、0.83%、0.94%、0.53%、0.88%、0.69%、 0.39%、 0.23%、 0.45%， 表 明 溶 液 在24 h内稳定性良好。

2.5.8 加样回收率试验 精密称取同一批颗粒（批号170105）6 份，每份约0.25 g，精密加入等量对照品，按“2.5.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷平均加样回收率分别为100.89%、101.34%、97.34%、98.36%、102.69%、100.29%、98.03%、99.64%、100.50%，RSD 分 别 为 1.48%、 1.51%、 2.16%、 1.40%、2.20%、1.86%、1.88%、0.79%、1.22%。

2.5.9 样品含有量测定 精密称取12 批颗粒，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1” 项色谱条件下进样测定，结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 讨论

3.1 含有量测定成分筛选 抗病毒颗粒中银花连翘为君药，既有辛凉透表、清热解毒作用，又有芳香辟秽功效，臣以野菊花清热解毒、抗病毒，佐以蒲公英加强解毒、清热、清火之功，上述药材均有抗病毒作用［3-5］。

金银花中含有多种化学成分，主要是挥发油、黄酮、有机酸、三萜皂苷、环烯醚苷等，其中有机酸被认为是清热解毒物质基础，常以绿原酸为质控标准；黄酮是抗呼吸道病毒感染有效成分［6-9］；连翘主要含有萜类、苯乙醇及其苷类、木脂素、黄酮、挥发油等化合物，以连翘苷、连翘脂素、齐墩果酸、芦丁、连翘酯苷为主［10-11］；野菊花含有绿原酸、木犀草苷、咖啡酸［12-13］等，蒙花苷为其特征成分之一［14］；蒲公英活性物质包括黄酮、酚酸、三萜等［15］。因此，本实验同时测定绿原酸及其同分异构体（新绿原酸、隐绿原酸）［16-17］、异绿原酸B 及其同分异构体（3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸）［18］、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷的含有量，但由于连翘酯苷A 与其相邻色谱峰的分离度小于1.5，故不对其进行测定。

3.2 含有量测定方法筛选 本实验结合二极管阵列检测器的全波长扫描结果发现， 各成分在320 nm波长处均有较高吸收，而且基线平稳，分离度高，故选择其作为检测波长。然后，考察了甲醇-水、乙腈-水流动相系统，发现后者干扰少，各成分分离度较好，为了改善峰形，在水相中又加入甲酸，发现乙腈-水（含0.1%甲酸） 洗脱时出峰快，基线稳定，分离度高，峰形对称理想。

4 结论

本实验建立抗病毒颗粒HPLC 指纹图谱，并同时测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷9 种成分含有量，该方法准确、重复性好，可用于该制剂质量控制。同时，还发现色谱峰中除了所测定的指标成分外，还存在多种分离度较好的未知成分，可通过LC-MS等分析方法作进一步确定。