雷公藤多苷片诱导卵巢早衰模型小鼠的自身修复性研究

2019-10-15 06:08林慧文蔡中琼梁志健钟志勇
广州医药 2019年5期
关键词:动情周期早衰雷公藤

林慧文 吴 哲 梁 莹 蔡中琼 梁志健 钟志勇

1 广州市第十二人民医院(广州 510620) 2 广东省医学实验动物中心(佛山 528248)

雷公藤制剂是临床上常用的免疫制剂,在临床上主要用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、慢性肾病、各种类型的银屑病等,在妇科疾病尤其是子宫肌瘤、子宫内膜异位症等取得良好的效果,但对人体消化、血液、生殖、内分泌等系统均有损伤,特别是生殖毒性[1- 2]中的卵巢功能损害,表现为女性月经紊乱或闭经、性欲低下、卵巢早衰等。雷公藤多苷片是最早研制成功的、迄今应用最广泛的雷公藤制剂[3]。本实验旨在探讨雷公藤多苷片建立卵巢早衰小鼠模型的可行性,研究卵巢早衰模型小鼠的自身修复性变化,为深入研究POF 的病理生理机制和预防措施,探索安全有效的治疗方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

雷公藤多苷片,批号:20151002,远大医药黄石飞云制药有限公司产品;氯化钠注射液,批号:A16092708,贵州天地药业有限责任公司产品;小鼠E2试剂盒、批号:20161229,小鼠LH试剂盒、批号:20161227,小鼠FSH试剂盒、批号:20161227,南京建成生物工程研究所产品。SPF级BALB/c小鼠,40只,雌性,7~8周龄,由广东省医学实验动物中心,质量合格证号:44007200033964,动物饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物房,群养,5只/笼,采用12 h:12 h昼夜间断照明;自由进食饮水,动物实验证明号:00157546。本实验涉及的与动物试验相关的内容和程序经广东省医学实验动物中心伦理委员会审核,遵从实验动物使用和管理的相关法律法规,保证实验动物的福利,伦理审查编号为B201609-19。

1.2 仪器设备

显微图像软件,型号:CellSens Dimension;荧光显微镜、型号:BX41,生物显微镜,型号:CX21和BX43,均日本奥林巴斯公司产品;电子天平,型号:JEA3001,上海浦春计器有限公司产品;生物组织包埋机、型号:EG1150,轮转切片机、型号:RM2235,全自动脱水机、型号:ASP300S,全自动染色机、型号:Auto Stainer-XL,摊片机和烘片机、型号:HI1220,均为德国莱卡公司产品;全波长酶标仪,型号:Multiskan GO,美国Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.3 方法[4- 5]

SPF级Balb/c小鼠,饲养至12周龄后,对动物进行阴道涂片观察,连续7天,镜下观察,根据细胞分类,以判定动物的动情周期。选36只具有正常动情周期的动物,随机分为阴性对照组18只、模型组18只。模型组小鼠按50 mg/kg灌胃给予的雷公藤多苷片溶液,1次/天,连续14 d,阴性对照组动物同法灌胃给予等量纯净水。每天观察动物1次,造模期间每周测量1次,每天进行阴道涂片,观察动物的性周期。于造模14 d,停止造模28 d和35 d,每组取6只动物进行眼眶取血,稍静置,2 500 rpm离心15min,取上层血清,检测FSH、LH、E2含量。采血后颈椎脱臼处死,取双侧卵巢,测量脏器系数,中性甲醛固定,HE染色,做组织形态学检测。

2 结 果

2.1 一般临床观察和体质量结果(见表1)

实验期间,阴性对照组小鼠行为表现良好,毛发润泽、精神良好,行为活跃。模型组小鼠造模期间均表现为行动迟缓、精神萎靡,脱毛严重,饮食欠佳,倦怠等,且体质量有所减轻,模型小鼠在造模14 d的体质量与阴性对照组比较降低(P<0.05)。停止造模后,模型对照组小鼠行为,毛发、精神等方面都逐步恢复正常,模型组小鼠的体质量在各测定时间点与阴性对照组比较均无差异(P>0.05)。

表1雷公藤诱导卵巢早衰模型小鼠体质量的动态变化

注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。

2.2 雷公藤诱导卵巢造模模型小鼠动情周期的变化

阴性对照组小鼠在整个实验过程中,动情周期规律,紊乱率均为 0。模型组小鼠在造模前动情周期规律,紊乱率为0;造模1~14 d,模型组小鼠均出现动情周期延长,8~10 d/次,多处于动情间期,甚至无正常的动情周期,紊乱率为 100%。停止造模1~14 d,模型组小鼠动情周期规律逐步恢复,多处于动情前期和动情期,紊乱率为 100%。停止造模15~35 d,模型组小鼠动情周期规律逐步恢复正常,紊乱率为0。

2.3 雷公藤诱导的卵巢早衰模型小鼠血清中E2、FSH和LH水平动态变化(见表2)

表2雷公藤诱导的卵巢早衰模型小鼠血清E2、FSH和LH水平的动态变化

与阴性对照组比较,“*”P<0.05或“**”P<0.01。

与阴性对照组比较,模型对照组小鼠造模14 d、停止造模27 d、停止造模35 d的E2水平降低(P<0.01);模型对照组小鼠造模14 d、停止造模27 d、停止造模35 d的FSH水平升高(P<0.01);模型对照组小鼠造模14 d、停止造模 27 d、停止造模35 d的LH水平升高(P<0.01或P<0.05)

2.4 卵巢系数结果(见表3)

与阴性对照组比较,模型对照组小鼠在造模14 d、停止造模28 d和停止造模35 d的卵巢系数降低(P<0.01或P<0.05)。

表3雷公藤多苷片诱导卵巢早衰模型小鼠卵巢系数的动态变化

2.5 病理观察结果(见图1)

阴性对照组小鼠在各测定时间点的卵巢皮质髓质结构清晰,卵泡生长活跃,可见各级卵泡排列规律,颗粒细胞层次多,发育正常,卵巢内可见黄体发育良好,黄体细胞丰富。模型组小鼠在造模14 d,卵巢组织萎缩,体积减少,皮质髓质结构混乱,各级卵泡数量减少,闭锁卵泡增多、卵母细胞及透明带形态异常,呈变性、固缩或消失等退行性变化及空泡样改变;黄体数量减少、体积下降,形态不规律。停止造模28 d,模型组小鼠卵巢体积较阴性对照组减小,皮质髓质结构混乱,各级卵泡数量减少,闭锁卵泡增多,黄体数量正常、但形态不规律。停止造模35 d,模型组小鼠卵巢体积与阴性对照组比较明显减小,各级卵泡数量较模型对照组略微增多,但仍可见闭锁卵泡;黄体数量较多,但形态不规律。

3 讨 论

A、B:造模14 d,阴性对照组、模型对照组卵巢病理图片。C、D:停止造模27 d后,阴性对照组、模型对照组卵巢病理图片。E、F:停止造模35 d后,阴性对照组、模型对照组卵巢病理图片。图1 各组动物卵巢病理图片(HE染色×100)

卵巢早衰(POF)是女性在40岁以前持续性闭经和性器官萎缩,伴有卵泡刺激素(FSH)升高,雌性激素(E2)降低的综合征[6]。POF的病因复杂,主要与遗传因素、自身免疫性因素、医源性损伤、感染及环境的影响等多种因素所致[7]。雷公藤多甙片作为一种细胞毒性药物,对机体内迅速增生的细胞作用明显,如淋巴细胞和卵巢的卵泡细胞,可导致 DNA 碱基错配,引起 DNA 链断裂,推测对卵巢毒性的主要原因与损伤卵泡细胞 DNA 有关,从而引起卵泡分泌的雌激素水平下降,负反馈引起 FSH升高[8- 9],属于医源性损伤的一种常见情况。雷公藤制剂在临床上应用广泛,其巨大的毒性带来的损伤不容忽视。如何正确认识雷公藤制剂的治疗作用和毒性反应,提高临床用药的安全性,是我们筛选防治措施以及探讨疾病的发生、发展机制的首要问题。借助动物模型的研究,可以更准确地观察模型的实验结果,有助于更方便,更有效地认识人类疾病的发生发展规律。本研究采用雷公藤多苷片诱导卵巢早衰模型小鼠,研究小鼠在停止造模后体内激素以及卵巢的自身修复性变化,为深入研究POF 的发生发展机制和预防措施,探索安全有效的治疗方法提供实验依据。

FSH和LH为促性腺激素,由垂体前叶分泌,二者协同作用,促进卵泡发育成熟,调节体内E2的分泌[10]。FSH、LH水平是一种能够反映卵巢储备能力的指标,卵巢储备力降低能够导致FSH、LH水平升高。E2是由窦状卵泡所产生的,在FSH作用下,随着卵泡储存量的降低,E2水平也随之降低,进一步导致了FSH的升高,因此FSH、LH、E2的水平高低可作为监测卵巢储备能力的指标[11]。本实验研究结果显示,与阴性对照组比较,模型对照组小鼠的FSH、LH升高,E2下降,均有差异(P<0.05或0.01),说明雷公藤制剂成功诱导出卵巢早衰模型小鼠,而且停止造模35 d后,模型小鼠的血液指标尚未恢复正常。造模14 d,模型对照组动物卵巢萎缩、结构混乱,各级卵泡数量减少、闭锁卵泡增多,黄体数量减少、体积下降、形态不规律等病理变化。停止造模28 d和35 d,模型组小鼠的卵巢组织均较阳性对照组小,皮质髓质结构混乱,各级卵泡数量减少,闭锁卵泡增多,黄体数量正常、但形态不规律。

本研究结果显示,雷公藤多苷片可诱导的卵巢早衰模型小鼠,其作用机制可能与损伤卵巢细胞结构所引起卵巢萎缩有密切关系,动物卵巢受损害的病理结果与人类有一致之处(卵巢萎缩,各级卵泡减少,间质增加,淋巴细胞浸润等)。该模型在激素水平以及卵巢病理的自身修复需要较长的时间。

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